郭 華，王 珊，李春陽，莊志偉2

(1. 濰坊加易加生物科技有限公司，山東 濰坊 261108；2. 山東新希望六和集團有限公司，山東 青島 266000)

有機酸(酸化劑)是一類重要的抗生素替代化合物，近幾十年來在家禽日糧中的使用量有所增加。眾所周知，這些添加劑可通過細菌膜的去極化改變微生物種群，從而改變其內(nèi)部酸度，進而對家禽的胃腸道功能產(chǎn)生很大的影響[1]，并使家禽能夠更好地利用養(yǎng)分。近年來，在飲水中添加有機酸的情況有所增加。另一方面，據(jù)報道，飲水是家禽養(yǎng)殖場微生物傳播的最重要因素之一[2]。因此，在飲水中添加有機酸可能有利于增加肉雞消化道中有益菌的數(shù)量。本研究旨在通過探討在飲水中添加不同飲水型酸化劑對飲水內(nèi)菌落數(shù)量的影響以及添加不同飲水型酸化劑對經(jīng)大腸桿菌攻毒后蛋雞抗大腸桿菌侵染能力、腸道pH、腸道菌群組成和消化酶酶活力的影響，為飲水型酸化劑在蛋雞養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和分組

試驗選擇90羽25日齡的健康海蘭褐蛋雞，預(yù)試驗3 d；各組飼喂新希望六和配合全價料。在29日齡時，將90羽蛋雞隨機分為對照組、試驗組1和試驗組2，每組設(shè)6個重復(fù)，每個重復(fù)5羽。對照組的飲水中不加任何物質(zhì)，試驗組1的飲水加入0.1%的濰坊某公司生產(chǎn)的LDS(甲酸、乳酸和肉桂醛)，試驗組2的飲水加入0.1%的青島某公司生產(chǎn)的FLS(甲酸、丙酸和香芹酚)，每周連續(xù)使用4 d，每日保證至少10 h酸化水的飲量，自由飲水，自由采食、自然光照，試驗期為14 d。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑及菌種

LB液體培養(yǎng)基(L10010，青島海博生物有限公司)、胃蛋白酶試劑盒(HY-60091，上海紀寧生物科技有限公司)、胰蛋白酶活性檢測試劑盒(BC2310，上海紀寧生物科技有限公司)、淀粉酶活性檢測試劑盒(BC0615，上海紀寧生物科技有限公司)、大腸桿菌(由新希望六和動保中心臨床分離鑒定菌提供)、HiCrome(TM)ECC選擇性培養(yǎng)基[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]，乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基(HB0385-1，青島海博生物有限公司)等。

1.2.2 主要儀器

分光光度計(DR3900，美國哈希公司)，氣浴恒溫振蕩器(THZ-82A浙江賽德設(shè)備儀器有限公司)，pH計(PHS-25上海儀電科學(xué)儀器有限公司)，臺式冷凍離心機[3K15，SIGMA(中國)公司]等。

1.3 體外試驗：不同飲水型酸化劑的體外抗菌活性評價

將1 mL 2×105CFU/mL大腸桿菌注入9 mL LB液體培養(yǎng)基中。將不同濃度的酸化劑按體內(nèi)使用的相同濃度(自來水、0.1%LDS、0.1%FLS)加入不同的試管內(nèi)。然后在每個時間間隔用分光光度計測量吸光度后，將試管在37 ℃下孵育1 h、2 h和24 h。繪制不同吸光度的標準曲線，進行細菌計數(shù)。記錄處理樣本計數(shù)，并計算與各自對照相關(guān)的抑制率。

參考Bolder和Palmu的方法對用不同酸化劑處理后的蛋雞飲水細菌總數(shù)進行評價：家禽飲用結(jié)束后，采集不同處理組的水樣測定細菌總數(shù)，以評估不同酸化劑對蛋雞飲水中細菌的抑制能力。

1.4 體內(nèi)試驗：不同飲水型酸化劑的體內(nèi)試驗評價

體內(nèi)驗證試驗按照“1.1試驗動物和分組”所述，采取對不同酸化劑處理至42日齡時的試驗養(yǎng)殖對象進行攻毒(動物大腸桿菌病模型如下所述)，驗證不同飲水型酸化劑的實際應(yīng)用效果。

動物大腸桿菌病模型的建立：在42日齡進行大腸桿菌(由新希望六和動保中心臨床分離鑒定菌提供)攻毒試驗，從對照組隨機選取15羽蛋雞，隨機分為3組，每組5羽，用帶有刻度的軟管經(jīng)倒立的雞肛門緩慢插入并注入經(jīng)復(fù)蘇的臨床分離鑒定大腸桿菌到回腸處，攻毒劑量分別為0.3 mL和0.5 mL；在44日齡隨機宰殺，取23羽，其中試驗組各8羽，對照組7羽，在食道和腺胃、腺胃和十二指腸以及空腸和回腸各處結(jié)扎冷藏備用。

1.4.1 攻毒試驗

攻毒前復(fù)蘇90 mL大腸桿菌12 h，測得OD值為2.43；試探選擇攻毒劑量0.3 mL/羽和0.5 mL/羽，每個劑量組5羽，在攻毒1 h和1.5 h后觀察雞的糞便狀態(tài)和精神狀況；從有癥狀的攻毒雞中選擇攻毒劑量作為參考，再增加攻毒劑量到0.7 mL/羽和1 mL/羽，每個劑量攻毒5羽；觀察雞群是否有呼吸道癥狀以及精神狀態(tài)和糞便情況，若有，此時的劑量為攻毒劑量，分別在試驗組1和試驗組2中各攻毒5羽。

1.4.2 日常養(yǎng)殖狀況記錄

觀察雞群臨床狀態(tài)(精神、呼吸癥狀、糞便和羽毛蓬松)以及采食和飲水情況。

1.4.3 腸道檢測

將腸道內(nèi)容物和離子水按照1∶9(W/V)攪拌均勻后靜止5 min，用選擇性培養(yǎng)基在37 ℃經(jīng)24 h培養(yǎng)腸道微生物(乳酸菌/大腸桿菌) 或經(jīng)48 h培養(yǎng)乳酸菌并計數(shù)；對余下的檢測樣本按2 000 r/min～3 000 r/min離心5 min，取樣，用行業(yè)標準檢測方法檢測淀粉酶和胰蛋白酶的酶活力，再測定pH，每個樣本測2個平行樣，取其平均值。

1.4.4 腺胃檢測

在腺胃內(nèi)壁上用載玻片直接取黏液，每羽雞吸取用胃蛋白酶試劑盒檢測或?qū)⒗鋬龅南傥赣? ℃～8 ℃保鮮下解凍2 h～3 h，稱取 1 g腺胃黏液，加入9 g的pH 7.2～7.4的1×PBS液，充分混勻，在2 ℃～8 ℃下用2 000 r/min～3 000 r/min離心20 min，仔細收集上清液。分裝一份待檢測，其余冷凍備用。保存過程中如有沉淀，應(yīng)再次離心，每個樣本測2個平行樣，取其平均值。

1.5 統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，多重比較用LSD法。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”的方式表示。

2 結(jié)果

2.1 不同酸化劑對大腸桿菌培養(yǎng)的時間依賴性抑制作用

表1的結(jié)果表明，不同酸化劑發(fā)揮抑菌作用的時間不同，抑制培養(yǎng)基中大腸桿菌生長的能力也不同。0.1%LDS，1 h、3 h、24 h的抑制率分別為20.66%、42.74%、29.13%；0.1%FLS，1 h、3 h、24 h的抑制率分別為29.11%、49.19%、40.29%；對比相應(yīng)時間點的抑制率可以發(fā)現(xiàn)，0.1%FLS抑菌能力強于0.1%LDS。

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2.2 酸化劑對飲水樣時間依賴性抑制作用

經(jīng)不同酸化劑處理的飲水細菌總數(shù)評估結(jié)果見表2。與處理后7 d相比，感染后21 d，所有組(包括對照組)飲水的微生物含量都有所減少。感染7 d后，乙酸(3 m/L)和有機酸混合液處理組的飲水中細菌總數(shù)均顯著低于未處理的對照組飲水的(P＜0.05)。在感染21 d后，兩種酸化劑處理的飲水細菌總數(shù)同對照組相比，有減少的趨勢，無顯著性差異(P＞0.05)，對比相應(yīng)時間點的飲水樣中的細菌總數(shù)發(fā)現(xiàn)，0.1%LDS的抑菌能力強于0.1%FLS的，同“2.1不同酸化劑對大腸桿菌培養(yǎng)的時間依賴性抑制作用”的試驗結(jié)果一致。

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2.3 蛋雞攻毒后的臨床表現(xiàn)

2.3.1 對照組攻毒劑量的選擇及蛋雞臨床表現(xiàn)

分別對對照組的試驗蛋雞用0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL及1 mL的大腸桿菌液攻毒，所有攻毒蛋雞均進行正常采食和飲水，臨床表現(xiàn)如表3所示。用0.3 mL大腸桿菌液攻毒的蛋雞臨床癥狀同對照組的蛋雞一致。以精神狀態(tài)為評價指標，蛋雞用0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL和1 mL大腸桿菌液攻毒后，精神狀態(tài)依次呈現(xiàn)正常、不活潑、沉郁和縮頸以及閉眼狀態(tài)；以糞便狀態(tài)為評價指標，蛋雞用0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL及1 mL的大腸桿菌溶液攻毒后，糞便狀態(tài)依次呈現(xiàn)正常、稀薄/正常、稀便/稀便/變濃/正常及稀便/稀便/稀便/稀便；以呼吸道癥狀為評價指標，攻毒劑量0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL及1 mL，呼吸道癥狀依次呈現(xiàn)正常、正常、輕微及明顯；以羽毛狀態(tài)為評價指標，攻毒劑量0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL及1 mL，羽毛癥狀依次呈現(xiàn)正常、蓬松、蓬松及蓬松?？梢赃x擇1 mL攻毒劑量，既不影響飲水及采食，又可客觀明顯地評判臨床表現(xiàn)。

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2.3.2 各試驗組蛋雞攻毒1 mL大腸桿菌后的臨床表現(xiàn)

各試驗組蛋雞用1 mL大腸桿菌液攻毒后的臨床癥狀見表4。供試蛋雞注射1 mL大腸桿菌液后，兩種酸化劑處理的供試雞的精神狀態(tài)、糞便、呼吸道癥狀及羽毛五項指標以及采食和飲水均正常；解剖試驗組和對照組的蛋雞發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟器官均無任何異常變化。從臨床表現(xiàn)及剖解狀況可以說明，前期飼養(yǎng)添加飲水型酸化劑可以增強蛋雞機體的免疫力，增強抵抗大腸桿菌的侵染能力。

2.4 腸道腔內(nèi)pH

不同酸化劑對蛋雞腸道腔內(nèi)pH的影響見表5。對照組蛋雞空腸腔內(nèi)pH在6.14左右；FLS組蛋雞腸道腔內(nèi)的pH不穩(wěn)定，低于對照組蛋雞的，但無統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異(P＞0.05)；LDS組蛋雞腸道腔內(nèi)的pH基本穩(wěn)定在5.98，低于對照組蛋雞的，與對照組蛋雞相比存在統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異(P＜0.05)。酸化劑能調(diào)節(jié)蛋雞腸道腔內(nèi)的pH，有益于腸道微生物生長。

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2.5 腸道微生物

不同酸化劑對蛋雞腸道菌落數(shù)的影響見表6。從表6可看出，在蛋雞腸道中乳酸菌的數(shù)量上，實驗組和對照組的大小關(guān)系依次為：C0.1%LDS＞C0.1%FLS＞C對照，其中，0.1%LDS可顯著(P＜0.05)提高蛋雞腸道腔內(nèi)有益乳酸菌的數(shù)量，而0.1%FLS對蛋雞腸道腔內(nèi)有益乳酸菌的數(shù)量呈增長趨勢，且增長幅度大于其他試驗組蛋雞的。這說明酸化劑有益于蛋雞腸道有益菌群的生長，兩者都能起到調(diào)節(jié)蛋雞腸道微生物作用。

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2.6 不同酸化劑對蛋雞胃腸道消化酶的影響

不同酸化劑對蛋雞胃腸道消化酶的影響見 表7。從表7可知，除胃蛋白酶外，兩種酸化劑對蛋雞腸道淀粉酶和胰蛋白酶的酶活力均有增益作用，其中腸道淀粉酶酶活力和胰蛋白酶酶活力的大小關(guān)系：U0.1%LDS＞U0.1%FLS＞U對照；試驗組中蛋雞胃蛋白酶酶活力大小關(guān)系為U0.1%LDS＞U對照＞U0.1%FLS，且兩種酸化劑對淀粉酶酶活力的影響差異顯著(P＜0.05)，對胰蛋白酶酶活力及胃蛋白酶酶活力無顯著性影響(P＞0.05)。

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3 討論

本試驗結(jié)果所體現(xiàn)的有機酸效應(yīng)與之前的相關(guān)報道一致，有機酸影響了微生物細胞膜或細胞大分子的完整性，或者有助于殺菌效果的養(yǎng)分運輸和能量代謝[4]。在飲水中添加兩種不同酸化劑對家禽的影響有一定的差異，本研究結(jié)果與Owens等[5]的研究結(jié)果類似。Pirgozliev等[6]發(fā)現(xiàn)，由于添加有機酸，肉雞回腸和盲腸中的大腸桿菌數(shù)顯著減少，與本試驗對蛋雞腸道微生物中乳酸菌及大腸桿菌的追蹤結(jié)果基本一致。有機酸混合物的使用顯著降低了肉雞腸道中細菌總數(shù)和革蘭氏陰性菌的數(shù)量[7]，且使用酸化劑處理的家禽可以將癥狀和死亡率降至最低，減少飲水酸化引起的微生物脫落和定植，這可能是不同酸化劑抗菌作用的結(jié)果，也對胃腸道上皮細胞產(chǎn)生有利作用[8-9]。本試驗的兩種飲水用酸化劑使蛋雞在攻毒后的臨床癥狀上表現(xiàn)正常，同時解剖時的病理學(xué)檢測也正常，這在一定程度上反映了在前期飼養(yǎng)期間飼喂飲水型酸化劑可以提高蛋雞的抗大腸桿菌侵染能力，增強機體的免疫力。相關(guān)研究表明復(fù)合酸化劑可降低蛋雞嗉囊、腺胃、肌胃、小腸和大腸腔內(nèi)的pH，提高胰蛋白酶、胃蛋白酶和淀粉酶的酶活力[10-12]，本試驗在各消化酶的活力驗證指標上，除胃蛋白酶酶活力U0.1%FLS低于對照組的外，其余均符合這一規(guī)律。

4 結(jié)論

0.1%飲水型酸化劑可抑制飲水中的大腸桿菌，且可以通過調(diào)節(jié)蛋雞腸道腔內(nèi)的pH，改善消化酶活性及腸道微生物菌群組成，激活酶活，提高消化；通過肛門攻毒成功發(fā)病但未死亡，又可避開胃酸的影響，提供了一種細菌攻毒的新方法，為制造動物細菌發(fā)病模型開啟新思路和建立細菌發(fā)病動物模型提供了有力的證據(jù)，也有效補充了體外試驗，值得臨床試驗推廣；此外，用飲水型酸化劑處理的蛋雞攻毒后臨床及剖解均表現(xiàn)正常，證明此方式可以有效增強機體的免疫力；理論上，飲水酸化程度越高，效果越好，需要進一步的研究來評估家禽對水酸化的耐受程度以及飲水中酸化劑的持續(xù)或中斷供給是否有更好的效果。