夏海建 郭文杰 裴晉陽 施嘉欣 杜天琪 肖世長 侯磊 王慧穎 孫旭杰 蔣俊*

1. 揚州大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 揚州 225001 2. 江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

持續(xù)使用糖皮質(zhì)激素是造成骨量丟失、誘發(fā)繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的常見原因[1-3]。接受糖皮質(zhì)激素治療的患者每年骨量丟失約15%[4-5]，持續(xù)使用5年以上，病人骨折的發(fā)生率超過30%[6]。多種模式生物研究[7-9]表明，治療劑量的糖皮質(zhì)激素可擾亂破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞功能，抑制骨形成，促進(jìn)骨吸收，導(dǎo)致骨量丟失。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)、破骨細(xì)胞(osteoclast, OC)和成骨細(xì)胞(osteoblast, OB)是參與骨重建的主要細(xì)胞[10-12]。糖皮質(zhì)激素因破壞了骨形成和骨吸收之間的平衡，進(jìn)而誘發(fā)了骨質(zhì)疏松[13]。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2, RUNX-2)參與了OB成熟分化，能促進(jìn)MSCs向OB分化[14-15]。因此，研究活性成分與RUNX-2靶點的相互作用對闡述活性成分的抗骨質(zhì)疏松作用具有重要意義。

斑馬魚模型已被廣泛地應(yīng)用于中藥抗骨質(zhì)疏松研究，不僅可以用來快速篩選其活性成分，也可以用來探討活性成分的分子機(jī)制，尤其是斑馬魚胚胎暴露模型[16]。淫羊藿素(icaritin,IT)是淫羊藿中抗骨質(zhì)疏松活性最強(qiáng)的黃酮苷元[17-20]，但是采用斑馬魚模型評價IT的抗骨質(zhì)疏松活性及其機(jī)理的報道極少。因此，本研究將斑馬魚胚胎暴露在潑尼松龍(prednisolone, PNSL)溶液中，造成其骨形成過程抑制后，依次檢測其頭骨面積、頭骨累積光密度和全魚骨礦物質(zhì)含量，最終結(jié)合分子對接(molecular docking)技術(shù)闡述IT與RUNX-2蛋白靶點的相互作用，為揭示IT抗骨質(zhì)疏松機(jī)理提供重要數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥品與試劑：依替膦酸二鈉(DE，正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，純度≥99%)；淫羊藿素(實驗室自制，純度>98%)；潑尼松龍(PNSL，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；純度≥98%)；多聚甲醛(上海泰坦科技股份有限公司，純度≥95%)；3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS222, adamas-reagent，純度≥98%)；HNO3(上海泰坦科技股份有限公司)；其它為分析純。

1.1.2實驗動物：野生型斑馬魚胚胎(AB系，南京一樹梨花生物科技有限公司)。將斑馬魚胚胎先置于6孔板中，然后加入空白E3培養(yǎng)基，胚胎和幼魚在14 h/10 h光/暗循環(huán)的環(huán)境中保存，并且控制室溫在(28.5±0.5)℃[24]。

1.2 方法

1.2.1藥物的配制：取適量IT，精密稱定，首先用超純水配制成濃度為100 μg/mL的儲備液，再量取適量儲備液并分別稀釋成0.1、1和10 μg/mL的IT藥液。取適量依替膦酸二鈉，精密稱定，先配制成濃度為150 μg/mL的水溶液，再用培養(yǎng)基稀配成15 μg/mL的依替膦酸二鈉溶液(含0.5% DMSO)。取適量PNSL，精密稱定，DMSO促溶(≤10%)，先配制成濃度為250 μmol/L儲備液，再用培養(yǎng)基稀配成25 μmol/L的PNSL溶液(含0.5% DMSO)。

1.2.2斑馬魚分組與處理：將斑馬魚胚胎(受精后的第2天，2 PF)，放入裝3 mL空白培養(yǎng)基的6孔板中(每孔15只)。在3 PF，實驗分組為：對照組(E3培養(yǎng)基)，PNSL組(25 μmol/L)，DE組(15 μmol/L DE和25 μmol/L PNSL)，IT組(低、中、高劑量分別為：0.1、1.0或10.0 μg/mL IT和25 μmol/L PNSL)。每次喂食后清洗并更換空白E3培養(yǎng)基。

1.2.3骨骼和基質(zhì)染色：在10 PF，斑馬魚麻醉處死后用4%多聚甲醛的PBS緩沖液(pH 7.4)固定，茜素紅S(ARS, 0.5% KOH)染色12 h。準(zhǔn)時取出并將染色劑洗凈，新配制1% KOH和1.5% H2O2溶液交替漂洗1 h，再在甘油浸洗后借助顯微鏡獲取骨染色圖像。

1.2.4骨礦化分析：Image J軟件定量分析斑馬魚頭骨骨礦化面積(AMB)和累積光密度(COD)[21-22]。熒光倒置顯微鏡對頭骨腹側(cè)圖像進(jìn)行獲取。

1.2.5礦物質(zhì)含量檢測：電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測定斑馬魚全魚中鈣和磷的含量[21]。在10 PF，將收集的幼魚(n=15)用雙蒸水沖洗5次后，置于10 mL玻璃離心管中，用70% HNO3微波消解4 h。配備G3160B I-AS集成自動采樣器的7500cx ICP/MS系統(tǒng)對各組斑馬魚進(jìn)行鈣和磷的含量測定。

1.2.6分子對接：RUNX2序列采用同源建模獲得(template:1ljm CHAIN：A sequence identity：94% residue range：112-225)，借助Molecular Operating 2015.10版軟件，Maestro建立配體和IT的3D模型，誘導(dǎo)擬合對接模塊將配體裝配在蛋白質(zhì)內(nèi)部，最后進(jìn)行Glide評分。

1.3 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以均值± 標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示，用SPSS 19.0軟件(SPSS, Inc., Chicago, IL)進(jìn)行one-way ANOVA分析，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IT對骨礦化過程的影響

用IT的低、中、高劑量組(0.1、1.0、10.0μg/mL)將斑馬魚從3 PF孵育到10 PF，以探究IT作用下解除PNSL對斑馬魚幼魚骨形成的抑制。ARS染色結(jié)果顯示，與DMSO組相比，PNSL組的染色深度和染色面積均較低，而IT作用的三組染色深度和染色面積均較高(圖1)，說明IT解除了PNSL對斑馬魚幼魚骨形成的抑制。骨礦化面積(AMB)和累積光密度(COD)定量結(jié)果表明，與PNSL組相比， IT干預(yù)使斑馬魚的COD(圖2 A)和AMB(圖2B)值顯著升高(P< 0.01)，且有劑量依賴性。

圖1 IT對糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松斑馬魚的逆轉(zhuǎn)作用(n=15)Fig.1 Reversal effect of different concentration of Icaritin on glucocorticoid-induced osteoporosis in zebrafish (n=15)

圖2 IT對糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松斑馬魚的骨礦化影響(n=15)注：與對照組比較，#P<0.05；與模型組比較,**P<0.01。Fig.2 Effects of different concentrations of Icaritin on bone mineralization in zebrafish with glucocorticoid-induced osteoporosis (n=15)

2.2 IT對斑馬魚骨礦物質(zhì)含量的影響

骨組織中礦物質(zhì)的含量占總重量的69%～80%[23]，其中又以磷和鈣的含量最高。斑馬魚幼魚中Ca和P的測定結(jié)果表明：相比DMSO，PNSL能顯著降低斑馬魚鈣、磷水平 (P<0.01)。而與PNSL組相比，IT干預(yù)使斑馬魚鈣、磷水平顯著升高(P<0.01, 圖3)。隨著IT濃度從0.1 μg/mL增加到10 μg/mL，斑馬魚中鈣、磷元素的含量呈上升趨勢，且呈明顯劑量依賴性。

圖3 IT對糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松斑馬魚鈣和磷的影響(n=15)注：與對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，**P<0.01。Fig.3 Effects of different concentrations of Icaritin on calcium and phosphorus in zebrafish with glucocorticoid-induced osteoporosis (n=15)

2.3 IT與RUNX-2蛋白靶點的分子對接

Autodock計算機(jī)模擬結(jié)果顯示，IT可與RUNX-2發(fā)生對接，對接得分為-5.469 860 55，具體結(jié)果如圖4所示。IT與RUNX-2蛋白的結(jié)合位點主要是3號位的-OH和2號位的苯環(huán)，受體和配體產(chǎn)生相互作用基團(tuán)的距離分別為2.74和3.84，結(jié)合能量分別為-4.4和-1.3，一般來說能量越低，則結(jié)合越穩(wěn)定。具體數(shù)據(jù)如表1所示。分子對接結(jié)果顯示IT與RUNX-2蛋白有一定的結(jié)合能力。

圖4 受體RUNX-2與配體IT的最佳相互作用圖Fig.4 The best interaction diagram of receptor RUNX-2 with small ligand Icaritin

表1 受體RUNX-2與小分子配體IT的分子對接結(jié)果

3 討論

MSCs可以向成骨細(xì)胞分化，也可以分化為脂肪細(xì)胞，但是只有促進(jìn)其成骨分化才能為骨形成和骨修復(fù)提供細(xì)胞來源[24-27]。因此，研究活性成分促進(jìn)MSCs成骨分化的能力，是闡述藥物抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)理的重要途徑。RUNX-2是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)的下游調(diào)控因子[28-29]，RUNX-2也被稱為OB的主要轉(zhuǎn)錄因子，是促進(jìn)MSCs向OB分化和成熟[30]的重要因子。

本研究中設(shè)置了低、中、高3個劑量組IT(0.1、1.0、10.0 μg/mL)對糖皮質(zhì)激素所致骨形成抑制的斑馬魚進(jìn)行干預(yù)，表明IT能促進(jìn)斑馬魚的骨形成和骨礦化過程，且呈劑量依賴性，由此為淫羊藿素開發(fā)成抗骨質(zhì)疏松的替代藥物提供了數(shù)據(jù)支撐。