任良棟 ，郭維偉，陸奉勇，王 琪，付良輝，陸 捷，王瑞明

（1.濟(jì)南瑞豐生物工程有限公司，山東濟(jì)南 250353；2.齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353)

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，具有悠久歷史，是中華民族的燦爛瑰寶。近年來中國白酒發(fā)展迅速，特別是茅臺、五糧液等高端白酒企業(yè)快速發(fā)展，產(chǎn)值達(dá)千億規(guī)模。其中濃香型白酒市場占有率在80%以上，窖池固態(tài)發(fā)酵、續(xù)糟配料、混蒸混燒，是濃香型白酒生產(chǎn)特色。千年老窖萬年糟，好窖出好酒，窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣直接決定著濃香型白酒的質(zhì)量。為保證窖泥在使用過程中的質(zhì)量，加強(qiáng)窖泥管理，需對窖泥進(jìn)行定期檢測、維護(hù)和保養(yǎng)，為窖泥微生物提供適宜的生長棲息環(huán)境，這其中對窖泥的全方位了解是前提，因此建立一套系統(tǒng)的、完善的、易于操作的窖泥評價方法非常重要[1-4]。目前，對窖泥的檢測及評價方法研究較多，通過感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)判定窖泥質(zhì)量應(yīng)用較廣[5-6]，但該評價體系中的部分指標(biāo)并不能真實(shí)反映窖泥質(zhì)量狀況。還有些方法利用分子生物學(xué)手段檢測窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性[7-8]，該方法所需設(shè)備較為專業(yè)，對檢測人員知識水平要求高，很難適用于絕大多數(shù)企業(yè)。

本實(shí)驗(yàn)通過采集全國有代表性的46份窖泥，對窖泥感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)歸納總結(jié)各白酒企業(yè)窖泥數(shù)據(jù)，結(jié)合窖泥質(zhì)量制定了一套以“窖泥產(chǎn)酸能力”和常規(guī)檢測相結(jié)合的窖泥質(zhì)量判定體系，實(shí)驗(yàn)方法簡單，可操作性強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

窖泥樣品：取自不同地區(qū)的名優(yōu)濃香型白酒廠。將新鮮窖泥平攤于白瓷盤上，均勻風(fēng)干、粉碎、過篩后備用。

己酸菌培養(yǎng)基：乙酸鈉5 g/L；酵母粉5 g/L；硫酸銨4 g/L；磷酸氫二鉀0.2 g/L；硫酸鎂0.2 g/L；碳酸鈣5 g/L。

2 %（w/v）硫酸銅溶液：取2 g硫酸銅，溶解到100 mL蒸餾水中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水分、pH值、腐殖質(zhì)、氨態(tài)氮的檢測

參照《微生物與濃香型大曲酒生產(chǎn)技術(shù)》[9]。

1.2.2 窖泥產(chǎn)酸能力測定

1.2.2.1 測定步驟

（1）取3個500 mL三角瓶，用蒸餾水配制成1500 mL培養(yǎng)基，平均每瓶加450 mL，封口后，121 ℃滅菌30 min。

（2）待3個500 mL三角瓶培養(yǎng)基降溫至32～34 ℃時，放入無菌操作臺或無菌接種室紫外線滅菌20 min。

（3）稱取50 g窖泥分別加入3個三角瓶中，每瓶各加12.5 mL 95 %vol乙醇，封口后放置恒溫箱中，溫度32～34 ℃，培養(yǎng)7 d。

（4）前1～4 d，三角瓶中出現(xiàn)大量氣泡，8 d時檢測己酸含量。

1.2.2.2 測定方法

己酸定性檢測：首先取培養(yǎng)好的三角瓶中菌液3 mL放入比色管中，再加入2%的CuSO41 mL，然后加入乙醚2 mL，蓋好后搖均勻，靜置3 min，即看到比色管中分層，上層為綠色或淡綠色，表明有己酸產(chǎn)生，顏色越深，產(chǎn)己酸的量越大。

己酸定量檢測：發(fā)酵液預(yù)處理（1000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm超濾膜過濾后待用）后采用GB 1886.120—2015己酸檢測的方法測定。

1.2.2.3 定義

窖泥產(chǎn)酸能力：窖泥培養(yǎng)7 d后，100 mL窖泥培養(yǎng)液中生成的己酸毫克數(shù)，單位為mg/100 mL。

1.2.3 梭菌數(shù)測定方法

稀釋平板法[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同廠家窖泥水分含量的比較

窖泥風(fēng)干樣品見圖1。將窖泥樣品進(jìn)行水分含量測定，46份總樣品測定結(jié)果見圖2，水分含量分布圖見圖3。

通過對46份窖泥水分的測定結(jié)果可以看出，各酒廠窖泥的水分含量參差不齊，其中水分含量在30%以下的有7家，占總數(shù)的15.22%，這部分窖泥由于水分含量低，感官上已經(jīng)出現(xiàn)板結(jié)狀態(tài)，極易老化；另外水分含量在30%～40%的窖泥有28家，水分含量40%以上的有11家。水是微生物生長繁殖必不可少的條件，水分過少，微生物生長代謝困難，己酸菌易失活，窖泥容易老化板結(jié)；水分過大，窖泥則過濕、搭窖困難，池壁窖泥易滑落[11]。因此，水分含量在30 %以下的窖泥應(yīng)該及時補(bǔ)充水分，建議每排酒醅出池后，用優(yōu)質(zhì)己酸菌液養(yǎng)護(hù)，一方面可提高窖泥中水分含量，另一方面也提高窖泥中己酸菌等有益菌的數(shù)量。

2.2 不同廠家窖泥pH值的比較

窖泥是多種微生物棲息繁殖的場所，在白酒釀造過程中，窖泥中微生物不斷生長代謝，產(chǎn)生己酸、乳酸、丁酸等大量有機(jī)酸，并通過窖泥進(jìn)入酒醅中。如若窖泥酸度過大，會影響微生物細(xì)胞膜電荷變化，對窖泥微生物生長代謝產(chǎn)生抑制作用[12]。各廠家窖泥pH值情況見圖4、圖5。

從檢測結(jié)果可以看出，46份樣本窖泥絕大多數(shù)都在合理范圍內(nèi)，其中pH值在5.5以上的占比達(dá)78.46 %，這說明大部分酒廠在窖泥的制作及養(yǎng)護(hù)方面都做了不少工作；有17.39%的窖泥pH值呈弱堿性，聞氣味有氨味，可能是窖泥制作時堿性無機(jī)鹽添加過量或者感染了部分產(chǎn)氨細(xì)菌所致；另外還有19.57 %的窖泥pH＜5.5，酸性偏大，阻礙了窖泥中己酸菌的生長與代謝，pH值過低的原因主要與養(yǎng)護(hù)不當(dāng)有關(guān)，如使用含酸多的黃水和酒尾養(yǎng)護(hù)等，導(dǎo)致窖泥酸化、鈣化、甚至板結(jié)。

2.3 不同廠家窖泥腐殖質(zhì)含量的比較

腐殖質(zhì)是動植物殘?bào)w經(jīng)微生物分解轉(zhuǎn)化形成的膠體物質(zhì)，是土壤有機(jī)質(zhì)的主要組成部分(50%～65%)。腐殖質(zhì)主要由碳、氫、氧、氮、硫、磷等營養(yǎng)元素組成，腐殖質(zhì)具有適度的黏結(jié)性，能夠使黏土疏松，砂土黏結(jié)，是形成團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的良好膠結(jié)劑[13]。窖泥中腐殖質(zhì)是窖泥微生物的生長繁殖的基本養(yǎng)分，經(jīng)微生物酶代謝后形成多種有機(jī)大分子化合物，使窖泥具有良好的保水性，其含量高低可以判斷窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣。

圖6顯示窖泥腐殖質(zhì)含量相差較大，這和各企業(yè)窖泥制作方案各不相同有關(guān)，有些企業(yè)為了追求窖泥臭添加大量的爛水果及動物組織，雖然腐殖質(zhì)含量很高，但是出酒品質(zhì)不高，有些酒帶有明顯的泥臭味；同時有部分企業(yè)在制作窖泥時腐殖質(zhì)加的太少，窖泥腐殖質(zhì)含量不足2%，造成了窖泥失水，易老化板結(jié)。從圖7可以看出，大部分窖泥的腐殖質(zhì)含量都在合理水平，其中窖泥腐殖質(zhì)含量＞5%的占比46 %，窖泥腐殖質(zhì)含量≥2 %≤5 %的占比43%，另外也有5家窖泥腐殖質(zhì)含量不足2%，占到總樣本11%。

2.4 不同廠家窖泥氨態(tài)氮含量的比較

氨態(tài)氮的主要來源于窖泥中大曲、豆餅、硫酸銨等，是窖泥中微生物生長、代謝所必需的速效氮源，在人工窖泥培養(yǎng)時加入量要適中，其含量隨著窖泥窖齡的延長不斷升高[14]。氨態(tài)氮含量少窖泥營養(yǎng)匱乏，窖泥微生物生長受抑制，過剩則容易導(dǎo)致泥臭味明顯，各廠家氨態(tài)氮檢測結(jié)果見圖8、圖9。

根據(jù)窖泥理化、微生物指標(biāo)評定體系[3]，100 g絕干窖泥中氨態(tài)氮含量在80～250 mg之間為宜。通過對樣本窖泥氨態(tài)氮的檢測，發(fā)現(xiàn)有一半廠家的窖泥氨態(tài)氮含量是非常合適的，說明大部分廠家人工窖泥培養(yǎng)氨態(tài)氮加入量比較適宜；有43 %的廠家窖泥氨態(tài)氮含量＞250 mg/100 g，這與窖泥窖齡比較長和人工窖泥氨態(tài)氮物質(zhì)加入量都有關(guān)；有7%的廠家窖泥中氨態(tài)氮含量不足80 mg/100 g，氨態(tài)氮含量過低，窖泥營養(yǎng)匱乏，窖泥功能菌生長繁殖受阻，窖泥質(zhì)量不高。

2.5 不同廠家窖泥產(chǎn)酸能力的比較

窖泥中微生物的生長、代謝、繁殖以及相互作用造就了以己酸乙酯為主體香的濃香型白酒典型風(fēng)格[15]。己酸乙酯是微生物產(chǎn)生的己酸和乙醇在生物酶作用下形成的香氣成分，己酸產(chǎn)生菌的產(chǎn)酸能力決定著己酸生成量，其中克氏梭菌（Clostridium kluyveri）是主要的產(chǎn)己酸微生物之一[16-17]。通過本公司對窖泥微生物多年的檢測發(fā)現(xiàn)，各窖泥在菌落總數(shù)方面差異不大，該指標(biāo)不能清晰反映窖泥質(zhì)量。而通過對窖泥培養(yǎng)測定己酸產(chǎn)量可以反映出窖泥中產(chǎn)己酸的克氏梭菌數(shù)量和活力。

圖10是窖泥培養(yǎng)7 d后己酸定性檢驗(yàn)結(jié)果，大部分窖泥產(chǎn)酸能力不錯，產(chǎn)酸強(qiáng)的窖泥乙醚層呈深綠色，也有部分窖泥乙醚層不顯色。進(jìn)一步對窖泥培養(yǎng)液進(jìn)行己酸定量檢測的結(jié)果見圖11，窖泥產(chǎn)酸能力相差很大，其中產(chǎn)酸能力在300 mg/100 mL以上的有15家窖泥，占32.6%；產(chǎn)酸能力在200～300 mg/100 mL的有9家，占19.56%；產(chǎn)酸能力在100～200 mg/100 mL的有15家，占32.6 %；產(chǎn)酸能力在100 mg/100 mL以下的有7家，占15.22%。根據(jù)窖泥培養(yǎng)液定性和定量檢測結(jié)果，把窖泥分為4個等級，劃分結(jié)果見表1。

表1 窖泥產(chǎn)酸等級劃分

產(chǎn)酸能力在300 mg/100 mL以上的窖泥培養(yǎng)液，乙醚層顏色最深，產(chǎn)酸能力不足100 mg/100 mL的窖泥培養(yǎng)液，乙醚層無顏色。因此窖泥經(jīng)過培養(yǎng)后，硫酸銅顯色反應(yīng)可以作為窖泥產(chǎn)酸能力強(qiáng)弱的判定指標(biāo)，該方法簡單易行。為了驗(yàn)證該判定指標(biāo)的實(shí)際意義，研究了窖泥產(chǎn)酸能力和窖泥中梭菌屬量的關(guān)系圖及不同產(chǎn)酸能力窖泥出酒指標(biāo)比較。

2.6 不同產(chǎn)酸能力窖泥梭菌數(shù)比較

窖泥中微生物種類繁多，其中梭菌是常見的窖泥可培養(yǎng)微生物，能有效水解淀粉和蛋白質(zhì)，促進(jìn)釀酒微生物的生長繁殖，能產(chǎn)生己酸、丁酸等有機(jī)酸，是窖泥重要的產(chǎn)酸和產(chǎn)香菌，其中常見的有己酸菌、丁酸菌等[18]。研究表明，梭菌產(chǎn)生的丁酸和己酸等酸類物質(zhì)是白酒重要的風(fēng)味化合物丁酸乙酯和己酸乙酯等酯類化合物的重要前體物質(zhì)[19]。因此窖泥中梭菌的數(shù)量在一定程度上反映出窖泥的產(chǎn)酸產(chǎn)香能力。窖泥梭菌的數(shù)量和窖泥產(chǎn)酸能力之間的關(guān)系見圖12。

通過對樣本梭菌數(shù)和窖泥產(chǎn)酸能力進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在線性關(guān)系，從圖12可以看出，產(chǎn)酸強(qiáng)的窖泥中梭菌數(shù)相對較多，隨著梭菌數(shù)量的減少，窖泥的產(chǎn)酸能力逐漸變?nèi)?。?dāng)梭菌數(shù)在10萬級單位時，窖泥產(chǎn)酸能力非常弱，甚至己酸定性實(shí)驗(yàn)已經(jīng)反映不出己酸的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，窖泥產(chǎn)酸能力的測定可以反映出窖泥中梭菌的數(shù)量，對研究窖泥質(zhì)量具有指導(dǎo)意義。

2.7 不同產(chǎn)酸能力窖泥出酒指標(biāo)比較

濃香型白酒中四大酯（乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯）的含量和比例是白酒品質(zhì)的重要參考因素，其中己酸乙酯的含量是各廠家內(nèi)控質(zhì)量指標(biāo)。窖泥是濃香型白酒的基礎(chǔ)，是己酸乙酯形成最為重要的因素。為研究窖泥產(chǎn)酸能力和出酒品質(zhì)的關(guān)系，通過對同一時間段不同窖泥廠家的混合原酒進(jìn)行取樣，測定白酒中四大酯含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖13。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同窖泥產(chǎn)酸能力對原酒四大酯含量影響較大，其中己酸乙酯變化最明顯，窖泥產(chǎn)酸能力越強(qiáng)原酒中己酸乙酯含量越高，己酸乙酯含量平均407.5 mg/100 mL，隨著產(chǎn)酸能力的下降，原酒己酸乙酯含量也逐漸降低，其中不產(chǎn)酸窖泥的原酒乙酸乙酯已經(jīng)降到100 mg/100 mL以下；乙酸乙酯和乳酸乙酯的變化正好相反，隨著窖泥產(chǎn)酸能力下降，乙酸乙酯和乳酸乙酯逐漸升高，其中以乳酸乙酯升高最為明顯，說明窖泥產(chǎn)酸能力下降后，窖泥中梭菌數(shù)量減少，導(dǎo)致乳酸菌等雜菌大量繁殖，打破了白酒四大酯平衡，白酒質(zhì)量明顯下降。從該項(xiàng)研究可以得出結(jié)論，窖泥產(chǎn)酸能力指標(biāo)可以作為判斷原酒中四大酯尤其是己酸乙酯的含量，可以作為評判窖泥質(zhì)量優(yōu)劣的判定指標(biāo)之一。

3 討論

好窖出好酒，優(yōu)質(zhì)窖泥是生產(chǎn)優(yōu)級濃香型白酒的基礎(chǔ)，通過檢測分析窖泥的各項(xiàng)指標(biāo)，采用人工干預(yù)方式，彌補(bǔ)窖泥缺陷是白酒生產(chǎn)企業(yè)必備技能。對46家白酒企業(yè)窖泥的感官、理化、微生物及產(chǎn)酸能力做了系統(tǒng)分析論證，研究了窖泥的感官、理化指標(biāo)、產(chǎn)酸能力與濃香型白酒質(zhì)量的相關(guān)性。窖泥檢測結(jié)果表明，在對窖泥感官及理化指標(biāo)評定的基礎(chǔ)上，對窖泥產(chǎn)酸能力指標(biāo)進(jìn)行檢測分析，可以客觀評價窖泥的質(zhì)量優(yōu)劣。利用窖泥產(chǎn)酸能力測定替代傳統(tǒng)窖泥的窖泥菌落總數(shù)及梭菌計(jì)數(shù)，結(jié)合窖泥感官指標(biāo)和理化指標(biāo)，判斷窖泥質(zhì)量。該方法成本低、操作簡單、結(jié)果可靠，適用于白酒企業(yè)窖泥質(zhì)量的檢測，尤其是提高了中小白酒企業(yè)窖泥檢測的可行性。