張俊平,李春華,蔣鳳英,林 鷙,倪建平,趙本進(jìn)?,楊惠萍

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海201106;2 上海佳牧生物制品有限公司,上海201403)

鴿Ⅰ型副黏病毒(Pigeon Paramyxovirus Ⅰ,PPMV-Ⅰ)病俗稱鴿瘟、鴿新城疫,是由副黏病毒科副黏病毒屬的禽Ⅰ型副黏病毒(Avian ParamyxovirusⅠ,APMV-Ⅰ)引起的高度接觸性、急性傳染病,傳播迅速、死亡率高,是目前危害我國養(yǎng)鴿業(yè)的主要疫病之一[1-2]。 該病流行期長,鴿群常常突然發(fā)病,迅速蔓延,其臨床癥狀與雞新城疫相似,主要臨床特點(diǎn)是腸炎、下痢和神經(jīng)癥狀,尤以嗜神經(jīng)速發(fā)型多見[3]。 1981 年,該病首先在蘇丹和埃及的信鴿中發(fā)現(xiàn),然后迅速傳播到歐洲、加拿大、美國等地[4]。 我國于1985 年首次分離到該病毒,目前全國大多數(shù)地區(qū)已經(jīng)有該病的報道[5]。 朱杰等[6]認(rèn)為,PPMV-Ⅰ是雞新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的變異株,它不同于典型的NDV,是兩個不同宿主的適應(yīng)株,兩個毒株既有共同特性,也有不同之處。 國內(nèi)外學(xué)者花費(fèi)了大量精力來研究NDV 不同毒株間的鑒定和分類方法,有的根據(jù)病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行分類,如根據(jù)病毒致病性強(qiáng)弱可將NDV 分為強(qiáng)毒株、弱毒株和中等毒力的毒株;有的根據(jù)病毒的物理化學(xué)特性進(jìn)行分類,如熱穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)多肽或核苷酸序列的分析[7];也有通過單克隆抗體(mAb)的結(jié)合模式對不同毒株進(jìn)行分類[8]。 我國目前控制PPMV 病大多數(shù)采用NDV 疫苗(滅活疫苗、弱毒∕中等毒力活疫苗),雖然PPMV 與NDV 存在非常高的交叉反應(yīng),但是在生產(chǎn)實(shí)踐中證實(shí)用NDV 疫苗免疫效果不夠理想,常常會出現(xiàn)免疫失敗[9]。 目前國內(nèi)沒有針對PPMV 病的特效藥,為了有效預(yù)防該病,上海佳牧生物制品有限公司研制了鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗(S-1 株)。 確定疫苗的臨床免疫途徑是疫苗研制必不可少的環(huán)節(jié),因此,本試驗按照獸用生物制品的研究指導(dǎo)原則,通過一系列試驗確定鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗(S-1 株)的免疫途徑,以期為疫苗的使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種毒

鴿副黏病毒Ⅰ型種毒(S-1 株)由上海佳牧生物制品有限公司研發(fā)中心科技人員于2009 年在上海郊區(qū)某鴿場分離、鑒定和保存[10],病毒血凝價HA:1∶256,雞胚半數(shù)致死量:107.5ELD50∕(0.1 mL),MDT(最小致死量病毒致死雞胚平均時間):64.8 h,ICPI(1 日齡雛雞腦內(nèi)注射的致病指數(shù)):1.3625,IVPI(6 周齡雛雞靜脈致病指數(shù)):0.75。

1.2 儀器與試劑

立式膠體磨:上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司;水浴鍋:國華電器有限公司;電子天平:賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;滅菌柜:張家港環(huán)宇制藥設(shè)備有限公司;潔凈烘箱:上海華東制藥設(shè)備有限公司。 吐溫-80、硬脂酸鋁及司本-80 購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,均為分析純;獸用白油:浙江正信石油科技有限公司。

1.3 試驗鴿

上海青浦養(yǎng)鴿場提供的30 d 低抗體幼齡鴿(HI 抗體≤2)和120 d 低抗體青年鴿(HI 抗體≤2)。

1.4 疫苗

試驗用鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗(S-1 株)為上海佳牧生物制品有限公司實(shí)驗室制品。 病毒液為通過尿囊腔接種SPF 雞胚收獲感染尿囊液獲得,病毒含量均在108.0EID50∕(0.1 mL)以上,檢驗合格的病毒液與獸用白油1∶1乳化獲得鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗(S-1 株),并經(jīng)檢驗為合格疫苗,疫苗生產(chǎn)批號分別為:160301、160302、160303。 試驗在上海佳牧生物制品有限公司實(shí)驗動物房內(nèi)進(jìn)行。

1.5 不同免疫途徑免疫低抗體幼齡鴿(30 d)的抗體消長試驗

1.5.1 試驗鴿分組及免疫

將80 只30 d 的低抗體幼齡鴿隨機(jī)分為4 組,每組20 只。 其中第1、2、3 組為試驗組,每組10 只以頸部皮下注射,另外10 只以胸部肌肉注射,分別接種鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗(S-1 株)實(shí)驗室制品160301批、160302 批和160303 批,免疫劑量為0.2 mL∕只。 第4 組不接種作為對照組。 所有試驗鴿在同等條件下隔離飼養(yǎng),提供優(yōu)質(zhì)的飼料和清潔的飲水。

1.5.2 試驗鴿觀察

免疫后每日觀察試驗鴿的飲食狀況、精神狀態(tài)、糞便及注射部位是否有異常,記錄不良反應(yīng)情況,待試驗結(jié)束時比較試驗組和對照組試驗鴿的體重差異并剖檢試驗鴿,觀察注射部位疫苗吸收情況。

1.5.3 試驗鴿抗體檢測

免疫后每2 周采血,分離血清,按常規(guī)微量法[11]測定試驗鴿HI 抗體產(chǎn)生情況,HI 效價判定以完全抑制血凝的最高稀釋度為終點(diǎn),以χlog2 表示,每次均需重復(fù)1 次,最后取平均值作為判定結(jié)果。 直至免疫后20 周,比較兩種不同免疫途徑免疫低抗體幼齡鴿產(chǎn)生抗體的差異。

1.6 不同免疫途徑免疫低抗體青年鴿(120 d)的抗體消長試驗

1.6.1 試驗鴿分組及免疫

將80 只120 d 低抗體青年鴿隨機(jī)分為4 組,每組20 只。 其中第1、2、3 組為試驗組,每組10 只以頸部皮下注射,另外10 只以胸部肌肉注射,分別接種鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗(S-1 株)實(shí)驗室制品160301批、160302 批和160303 批,免疫劑量為0.5 mL∕只。 第4 組不接種作為對照組。 所有的試驗鴿在同等條件下隔離飼養(yǎng),提供優(yōu)質(zhì)的飼料和清潔的飲水。

1.6.2 試驗鴿觀察

同1.5.2。

1.6.3 試驗鴿抗體檢測

同1.5.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同免疫途徑免疫低抗體幼齡鴿(30 d)抗體消長情況

用實(shí)驗室試制的3 批鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗(S-1 株)分別頸部皮下或胸部肌肉注射免疫30 d 低抗體幼齡鴿,通過對免疫試驗鴿的臨床觀察和抗體水平監(jiān)測發(fā)現(xiàn):頸部皮下和胸部肌肉注射免疫30 d 低抗體幼齡鴿均無異常反應(yīng),精神狀況良好,羽毛有光澤,飲食正常,糞便正常,注射部位無明顯變化,剖檢未見異常,試驗組和對照組鴿體重?zé)o明顯差異,兩種免疫途徑抗體水平差異不顯著,抗體水平自免疫后2周逐漸升高,直至免疫后第8 周達(dá)到最高,然后逐漸降低。 具體抗體水平見表1。

表1 不同免疫途徑免疫低抗體幼齡鴿抗體消長情況(log2)Table 1 Antibody detection of 30-day-old pigeons with low-HI antibody by different inoculation routes(log2)

2.2 不同免疫途徑免疫低抗體青年鴿(120 d)抗體消長情況

用實(shí)驗室試制的3 批鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗(S-1 株)分別頸部皮下或胸部肌肉注射免疫120 d 低抗體青年鴿,通過對免疫后試驗鴿的臨床觀察和抗體水平監(jiān)測發(fā)現(xiàn):頸部皮下和胸部肌肉注射免疫120 d低抗體青年鴿均無異常反應(yīng),精神狀況良好,羽毛有光澤,飲食正常,糞便正常,注射部位無明顯變化,剖檢未見異常,試驗組和對照組鴿體重?zé)o明顯差異,兩種免疫途徑抗體水平差異不顯著,抗體水平自免疫后2 周逐漸升高,直至免疫后8—10 周達(dá)到最高,然后逐漸降低。 具體抗體水平見表2。

表2 不同免疫途徑免疫低抗體青年鴿抗體消長情況(log2)Table 2 Antibody detection of 120-day-old pigeons with low-HI antibody by different inoculation routes(log2)

3 結(jié)論與討論

根據(jù)試驗結(jié)果判定,鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗(S-1 株)對30 d 低抗體幼齡鴿和120 d 低抗體青年鴿安全,并從第2 周開始抗體水平逐漸升高,直至第8 周左右達(dá)到峰值,然后逐漸下降。

試驗表明,鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗(S-1 株)頸部皮下和胸部肌肉兩種不同免疫途徑免疫30 d 低抗體幼齡鴿、120 d 低抗體青年鴿產(chǎn)生的抗體水平無明顯差異。 因此,在鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗(S-1 株)制造及檢驗試行規(guī)程中規(guī)定:該疫苗的免疫途徑為胸部肌肉注射或皮下注射。

在本試驗中,鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗(S-1 株)油佐劑制備使用的白油是國產(chǎn)獸用白油,黏度[運(yùn)動黏度(40 ℃)]為7.89 mm2∕s,疫苗劑型是油包水單相苗。 兩種免疫途徑對鴿抗體水平的產(chǎn)生影響差異不大,但是抗體水平達(dá)到峰值卻需要8—10 周,時間較長。 在試驗鴿免疫過程中發(fā)現(xiàn),雖然胸部肌肉和頸部皮下注射免疫試驗鴿均無異常反應(yīng),但是當(dāng)注射劑量偏大時(0.5 mL),注射過程稍稍有困難。 因此,可選擇更優(yōu)質(zhì)的佐劑,例如進(jìn)口白油、蜂膠、弗氏佐劑、ISA206VG 佐劑等制備鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗(S-1株),獲得更好劑型的疫苗,減少注射時的阻力,讓動物體內(nèi)抗體盡早產(chǎn)生,并且盡可能維持較長時間的較高水平的抗體滴度,從而減少疫苗注射過程可能對鴿造成的應(yīng)激反應(yīng)。