張春英,張 杰,龔 睿

(上海植物園,上海城市植物資源開發(fā)應(yīng)用工程技術(shù)研究中心,上海200231)

海濱木槿(Hibiscus hamabo)和木槿(H.syriacus)為錦葵科木槿屬落葉灌木[1-2]。 海濱木槿分布于浙江舟山、寧波等沿海一線海塘(堤),是一種極耐鹽堿和干旱瘠薄、耐海潮間歇性淹沒和海浪濺潑、抗風性特強的木本花卉和海岸基干林帶、鹽堿地綠化造林樹種[3]。 木槿分布廣泛,具有花期長、抗性強、容易養(yǎng)護等優(yōu)點,是國內(nèi)外園林中重要的夏花灌木之一[2]。 該兩種木槿屬植物因其優(yōu)良特性在綠化中廣泛應(yīng)用,相關(guān)研究也日益受到關(guān)注,主要集中在形態(tài)和生物學特性、光合特性、鹽及水脅迫抗逆等方面[4-5],但其育種相關(guān)研究報道很少,僅見李秀芬等[6]和李玉萍等[7-8]相關(guān)研究。 海濱木槿目前僅發(fā)現(xiàn)原種,未見種下變異,均為黃色單瓣花[9],花色單一,且開花比較稀疏,觀賞價值有待提高。 木槿花色豐富,耐寒性強,但是株型比較單一,抗病蟲害能力也有待提高。 木槿屬內(nèi)種間雜交存在生殖隔離,雜交親和率低[7],通過種間雜交擴大變異譜,獲得優(yōu)良變異單株篩選新品種的難度較大。 因此,如何誘發(fā)較高的變異率是海濱木槿和木槿新品種培育的關(guān)鍵技術(shù)。

電子束輻照技術(shù)即利用電子加速器產(chǎn)生的低能或高能電子束,輻照作用對象,使之發(fā)生常規(guī)方法難以引發(fā)的物理、化學及生物學反應(yīng),從而使其品質(zhì)或性狀得以改善或保持[10]。 電子束輻照技術(shù)同廣泛應(yīng)用的60Co-γ 射線一樣可用于農(nóng)作物、花卉、林木等進行誘變育種。 而且,相比于60Co-γ 射線,電子束輻照誘變具有安全性好、射線利用率高、輻射損傷低、誘發(fā)變異頻率高、變異譜廣等優(yōu)點,是一種高效的植物育種技術(shù)[11-12],可為觀賞植物新品種選育提供多方向和廣泛變異。 目前,已利用電子束輻照技術(shù)成功誘變選育了水稻、小麥、大麥、高粱、枸杞等多個禾谷類作物或經(jīng)濟作物品種[12],而且也開展了深入的機理研究[13-14]。 相對而言,電子束輻照誘變在觀賞植物誘變中應(yīng)用較少,尚未見在木槿屬植物誘變育種方面的報道。 本研究選擇海濱木槿和木槿種內(nèi)自然雜交干種子為材料,分析電子束輻照對其種子萌發(fā)及幼苗生長的影響,確定電子束輻照的合適劑量范圍,研究幼苗變異的表現(xiàn),以期為提高兩種木槿屬植物的種內(nèi)變異率和獲得優(yōu)良種質(zhì)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

誘變的植物材料為海濱木槿和木槿種內(nèi)自然雜交的當年成熟干種子。

1.2 試驗方法

電子束照射采用上海市農(nóng)業(yè)科學院的直線電子加速器產(chǎn)生的能量為10 MeV 的電子束,輻照劑量范圍在200—500 Gy,設(shè)置200 Gy、250 Gy、300 Gy、350 Gy、400 Gy、450 Gy、500 Gy 7 個輻照梯度。 每個輻照劑量處理100 粒種子,5 次重復(fù),共500 粒種子,并設(shè)置不輻照的對照。 種子輻照處理后于4 月份播種在育苗穴盤中,基質(zhì)為草炭和珍珠巖按1∶1混合后充分澆水,播種后放置在普通的塑料大棚中,經(jīng)常噴水保持基質(zhì)濕潤,定期調(diào)查種子發(fā)芽數(shù)量和幼苗生長狀況。 種子播種后,每天觀察萌發(fā)情況并記錄發(fā)芽的日期、發(fā)芽數(shù)量,直到?jīng)]有新的種子萌發(fā)為止,計算發(fā)芽率。 發(fā)芽完成后,查看幼苗葉片是否生長正常,有無異常葉片,幼苗生長穩(wěn)定后統(tǒng)計每個處理的成苗數(shù)量,計算成苗率。

發(fā)芽率=(種子發(fā)芽數(shù)∕供試種子數(shù)) ×100%

成苗率=(成苗數(shù)量∕供試種子數(shù)) ×100%

當年11—12 月份測量幼苗生長指標。 株高用卷尺測量植物自地上基部到頂端生長點的高度;地徑為離開地面上1 cm 處的莖桿直徑,用游標卡尺測量;節(jié)間長為主干上2 個節(jié)之間的長度。

1.3 輻照半致死劑量的確定

根據(jù)海濱木槿在不同劑量下的成苗率,擬合直線回歸方程Y=a+bX,導(dǎo)出成活率為50%(LD50)對應(yīng)的輻射劑量,以此作為確定海濱木槿種子輻照的最佳劑量范圍的依據(jù)[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束輻照對種子發(fā)芽和成苗率的影響

2.1.1 對海濱木槿種子發(fā)芽和成苗率的影響

電子束輻照對海濱木槿種子發(fā)芽率、始發(fā)芽時間及發(fā)芽完成時間均有顯著影響(表1)。 輻照顯著降低了種子的發(fā)芽率,但是隨輻照劑量增加發(fā)芽率降低的趨勢不明顯。 7 個輻照組中,250 Gy 和350 Gy 輻照組的發(fā)芽率與對照組無顯著差異,其余輻照組的發(fā)芽率均顯著低于對照組,500 Gy 輻照組發(fā)芽率最低,比對照組低64%,且顯著低于其他輻照組發(fā)芽率。 始發(fā)芽時間在輻照后有延遲的趨勢,250—400 Gy 劑量輻照組始發(fā)芽時間均比對照組晚,但無顯著差異,450 Gy 和500 Gy 輻照組始發(fā)芽時間顯著晚于對照組,比對照組晚2—3 d。 所有處理的發(fā)芽完成天數(shù)均在22—24 d,對照組為23 d,無顯著差異。

輻照組種子發(fā)芽后,部分幼苗根系發(fā)育異常,逐步死亡,成苗率顯著下降(表1)。 隨著輻照劑量的升高,成苗率急劇下降,均顯著低于對照組,較低劑量(200 Gy 與250 Gy)輻照組的成苗率較高,分別為56.2%和63.8%,300 Gy 輻照組下降至26.6%,350 Gy 輻照組為7.2%,400 Gy 輻照劑量以上成苗率不足2%,500 Gy 輻照組的幼苗均發(fā)育不良,最后全部死亡。 根據(jù)成苗率,導(dǎo)出擬合線形方程Y=106.6 -0.232X,由此計算出成苗率50%(半致死劑量LD50)的輻照劑量為243.97 Gy。

部分輻照處理的幼苗在生長過程中,第1—3 片真葉出現(xiàn)扭曲、皺縮、缺刻等變異現(xiàn)象,主要出現(xiàn)在劑量較低的200—300 Gy 輻照組,變異率在23%—58%,變異率最大的是輻照劑量最低的200 Gy 組,顯著高于對照組及其他處理組,其他高劑量輻照組變異率很低或未發(fā)現(xiàn)葉片變異現(xiàn)象,與對照組無顯著差異。隨著幼苗的生長,葉片逐漸轉(zhuǎn)為正常。

表1 電子束輻照對海濱木槿種子發(fā)芽及成苗率的影響Table 1 Effects of electron beam irradiation on seed germination and seedling rate of Hibiscus hamabo

2.1.2 對木槿種子發(fā)芽的影響

電子束輻照對木槿種子的發(fā)芽率、始發(fā)芽天數(shù)和幼苗葉片的變異率均有顯著影響(表2)。 在不同劑量輻照組處理中,除250 Gy 輻照組的發(fā)芽率與對照組無顯著差異外,其他處理均顯著低于對照組,輻照劑量在350—450 Gy 的發(fā)芽率較低,顯著低于其他輻照處理的發(fā)芽率,其中450 Gy 輻照組的發(fā)芽率最低(24.8%),比對照組低48%。 在對始發(fā)芽天數(shù)的影響方面,低劑量(200 Gy 和250 Gy)輻照組始發(fā)芽天數(shù)顯著縮短,比對照組約提前2 d,400 Gy 和500 Gy 高劑量輻照組顯著延長,比對照組延遲約1.5 d。 發(fā)芽完成時間均為20—21 d,不同劑量輻照處理與對照組均無顯著差異。

木槿幼苗成苗率隨輻照劑量的增加顯著降低,均顯著低于對照組成苗率。 200 Gy 輻照組的成苗率為21.8%,比對照組低43.8%;250 Gy 輻照組為6.2%,300 Gy 輻照組為7.2%,350 Gy 輻照組為1.2%,其余3 個較高劑量輻照組成苗率均在1%以下。 根據(jù)木槿幼苗的成苗率,導(dǎo)出擬合線形方程Y=94.03 -0.218X,由此計算出成苗率50%(半致死劑量LD50)的輻照劑量為201.97 Gy。

不同劑量輻照組的木槿幼苗與海濱木槿類似,幼苗第1—3 片真葉出現(xiàn)扭曲、缺刻等不規(guī)則變異,低劑量輻照組葉片變異率顯著提高,200 Gy 輻照組幼苗變異率最高,為32.4%,其次是300 Gy 輻照組(12.6%),其他輻照組的幼苗變異率均在10%以下,與對照組無顯著差異。 隨著幼苗的生長,葉片逐漸轉(zhuǎn)為正常。

表2 不同劑量電子束輻照對木槿種子發(fā)芽情況及成苗率的影響Table 2 Effects of electron beam irradiation on seed germination and seedling rate of Hibiscus syriacus

2.2 電子束輻照對幼苗生長指標的影響

2.2.1 對海濱木槿幼苗生長的影響

海濱木槿最高劑量500 Gy 輻照組幼苗全部死亡,因此試驗對輻照劑量200—450 Gy 輻照組幼苗生長數(shù)據(jù)進行分析。 根據(jù)生長指標統(tǒng)計,不同劑量電子束輻照顯著影響了海濱木槿幼苗的生長,尤其是高劑量輻照顯著降低了幼苗生長量(表3)。 幼苗株高在較低劑量輻照下顯著增高或無顯著差異,在高劑量輻照下顯著降低,200 Gy 輻照組的幼苗株高顯著高于對照組,比對照組高9%,250 Gy、300 Gy 輻照組的幼苗株高與對照組無顯著差異;350 Gy、400 Gy 和450 Gy 輻照組的幼苗株高均顯著低于對照組,比對照組低32%—44%,也顯著低于200—300 Gy 輻照組的幼苗株高。 幼苗地徑隨著輻照劑量的增加逐步降低,所有輻照組的幼苗地徑均顯著小于對照組,350 Gy 劑量以上輻照組的幼苗地徑顯著低于200 Gy、250 Gy 輻照組,350 Gy 輻照組的幼苗地徑最小,比對照組低41%。 幼苗節(jié)間長在較高劑量輻照組(350 Gy、400 Gy和450 Gy)顯著降低,比對照組低30%—37%,較低劑量(200—300 Gy)輻照組的幼苗節(jié)間長與對照組無顯著差異。

表3 電子束輻照對海濱木槿幼苗生長指標的影響Table 3 Effects of electron beam irradiation on seedling growth indexes of Hibiscus hamabo

2.2.2 對木槿幼苗生長的影響

各輻照處理組木槿均有一定數(shù)量正常生長的幼苗,在當年停止生長后,對幼苗的株高、地徑和節(jié)間長進行測量和統(tǒng)計分析。 根據(jù)分析結(jié)果(表4),輻照對幼苗的3 個生長指標均有一定影響,幼苗株高除350 Gy 輻照組外,其余輻照組的幼苗株高均顯著低于對照組,平均比對照組低19%—29%,但不同劑量的輻照處理間幼苗株高無顯著差異;輻照處理后,幼苗地徑有不同程度的降低,但僅有450 Gy 劑量組的地徑顯著低于對照組,比對照組低39%;輻照處理的幼苗節(jié)間長有不同程度的增加,但與對照組間均無顯著差異。

表4 電子束輻照對木槿幼苗生長指標的影響Table 4 Effects of electron beam irradiation on seedling growth indexes of Hibiscus syriacus

3 結(jié)論與討論

3.1 適宜的電子束輻照劑量

輻射誘變是通過增加變異率提高育種效率的一種育種手段,一定范圍內(nèi)輻照劑量可以提高植株的突變率和突變譜,但輻照劑量過高會導(dǎo)致植株存活率下降和不良突變增加,且不同的植株種類和生長狀態(tài)材料對輻照的敏感性不同[6]。 半致死劑量是確定輻照敏感性的主要指標,也是確定適宜輻照劑量的重要參考[15]。 輻照后的成活率或成苗率是計算半致死劑量的主要依據(jù)[15]。 本研究利用成苗率計算半致死劑量(LD50),海濱木槿半致死劑量為243.97 Gy,木槿半致死劑量為201.97 Gy。 相關(guān)研究多以半致死劑量上、下相差20%作為產(chǎn)生更多有益突變的適宜輻照劑量[16]。 因此,本試驗選用半致死劑量上、下相差20%的輻照劑量,確定海濱木槿干種子的電子束輻照適宜劑量為195.18—292.76 Gy,木槿干種子的輻照適宜劑量為161.58—242.36 Gy,木槿干種子比海濱木槿干種子對電子束輻照略微敏感一些。 植物種子半致死劑量同植物的種類、輻照能量、種子的輻照時期和輻照方法等都有一定的關(guān)系,因而半致死劑量隨著上述條件的不同有一定變化[17]。

3.2 海濱木槿干種子輻照的誘變變異苗期效應(yīng)

輻照對植物性狀的影響在幼苗期主要表現(xiàn)在生長指標方面,唐菖蒲、鹽角草、異子蓬和鹽地堿蓬等在電子束輻照后均有幼苗生長發(fā)生顯著變化,高劑量輻照抑制作用明顯[15,18]。 本研究中兩種木槿屬植物在輻照后幼苗也表現(xiàn)類似現(xiàn)象。 海濱木槿在不同劑量電子束輻照后,幼苗株高、地徑和節(jié)間長均在350 Gy劑量以上的輻照組顯著降低,說明在高劑量的電子束輻照作用下海濱木槿的生長受到顯著抑制;在較低劑量輻照處理中,3 個生長指標的表現(xiàn)出現(xiàn)了差異, 200 Gy 低劑量輻照處理顯著增加了幼苗株高,200—300 Gy輻照處理顯著降低了幼苗地徑,而對幼苗節(jié)間長無顯著影響。 木槿幼苗在輻照后株高顯著降低,但是隨輻照劑量增加生長量降低的趨勢不明顯,而地徑及節(jié)間長均無顯著變化。 以上結(jié)果表明,兩種木槿輻照后幼苗的株高均出現(xiàn)顯著差異,與玉米輻照后幼苗株高差異顯著一致[19]。 李秀芬等[6]使用60Co-γ輻照木槿、海濱木槿,在50—250 Gy 劑量范圍內(nèi)幼苗的株高與對照沒有顯著差異。 可見,電子束輻照有可能使株高的變異幾率更大,但是木槿、海濱木槿均為多年生木本植物,株高的差異能否在今后的生長中保持仍有待進一步觀測。

電子束輻照后幼苗除在生長指標上有差異外,幼苗早期的真葉也出現(xiàn)一定比例的畸形葉,2 種木槿屬植物均在第1—3 片真葉上出現(xiàn)扭曲、缺刻等現(xiàn)象,在低劑量輻照組畸形葉比例較高,劑量升高畸形葉比例降低甚至無畸形葉。 李秀芬等[6]使用60Co-γ 輻照時也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象,但是葉片畸形比例較高且隨著劑量的增加而升高。 此結(jié)果說明較低劑量(200—300 Gy)電子束輻照影響幼苗早期葉片的發(fā)育。 根據(jù)幼苗生長表現(xiàn),兩種木槿均在200—300 Gy 劑量下出現(xiàn)一定的差異,且成苗率較高,此劑量范圍正好在本試驗估算的適宜輻照劑量范圍之內(nèi),說明該劑量范圍的估算是合理的。