王明娟 朱青青 潘永良 徐天揚(yáng) 楊雨晨 張忠山

(湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江省媒介生物學(xué)與病原控制重點(diǎn)實驗室，湖州，313000)

大腦是最為精細(xì)和復(fù)雜的系統(tǒng)，由解剖上相連、功能上既相互獨(dú)立又相互影響的腦區(qū)組成[1]。隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病率的增加，對腦神經(jīng)科學(xué)的研究需求日益迫切[2]。嚙齒類動物由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)在解剖結(jié)構(gòu)、生物構(gòu)成及生理功能等方面與人類相似，且具有較完善的神經(jīng)行為評估系統(tǒng)，所以被廣泛應(yīng)用于各類研究[3]。其中一些新興物種在某些生理和行為上不同于傳統(tǒng)實驗物種，在建立某些特定疾病模型方面更具有優(yōu)勢，如長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)較大小鼠更適用于腦梗和癲癇模型的建立[4-6]。腦立體定位技術(shù)可以更好地了解各腦區(qū)甚至其分亞區(qū)的功能信息，因此在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型的建立和功能研究中備受關(guān)注[7-9]?，F(xiàn)含有空間立體定位信息的腦圖譜都局限于大小鼠等傳統(tǒng)實驗物種，無法滿足精確定位新興物種腦區(qū)三維坐標(biāo)的需求。此外，腦區(qū)坐標(biāo)會因體型和性別而異，即使是有圖譜的物種，定位過程中仍會有少許偏差而需反復(fù)調(diào)整，極大地影響了腦功能和精神障礙疾病的研究進(jìn)展。雖然有少量文獻(xiàn)報道了一些嚙齒類動物腦圖譜的構(gòu)建，但對于如何快速和準(zhǔn)確確定腦區(qū)三維坐標(biāo)的報道仍缺乏。因此，當(dāng)前實驗以長爪沙鼠為對象，通過制作尼氏染色圖譜和結(jié)合腦立體定位技術(shù)，旨在建立一套快速準(zhǔn)確和適用范圍較廣的，且能滿足不同體型、性別的腦區(qū)定位方法。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性長爪沙鼠35只，90日齡，體重(60±10)g，購于浙江省實驗動物中心，飼養(yǎng)在湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)平臺實驗動物中心。實驗期間長爪沙鼠均在(22±2) ℃、相對濕度(50±5)%環(huán)境下飼養(yǎng)。所有關(guān)于實驗動物的操作均遵守湖州師范學(xué)院實驗動物管理制度與操作規(guī)程，并盡可能減少動物的痛苦。

1.2 實驗器材與試劑

桌面型數(shù)顯型腦立體定位儀68005(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；KUY NICE SZM-7045 單臂雙目手術(shù)顯微鏡(北京天諾翔科學(xué)儀器有限公司)；恒流蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司)；Leica CM1850冰凍切片機(jī)(德國雷卡公司)；防脫載玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司)；尼氏染液(西格瑪奧德里奇公司)；酒精；二甲苯等。

2 研究方法

2.1 制備長爪沙鼠尼氏染色圖譜

灌流方法參考《大鼠腦組織灌注固定方法的改進(jìn)》[10]，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(8 mg/100 g體重)，開胸，于心尖部插入灌流針，經(jīng)左心室到達(dá)主動脈升部，先灌注生理鹽水6 min(10轉(zhuǎn)/min)，至右心耳流出透明清亮液體，4%多聚甲醛(4 ℃)灌流30 min(10轉(zhuǎn)/min)，取腦組織，后固定2 h，保存至30%蔗糖溶液(4 ℃)中脫水至鼠腦沉淀。后行40 μm冠狀冰凍切片后進(jìn)行尼氏染色[11]：將腦片置于尼氏染色液中染色3 min，后用蒸餾水洗滌2次(每次數(shù)秒即可)；再依次經(jīng)75%、95%、100%乙醇進(jìn)行濃度梯度脫水，最后直接浸于二甲苯中透明化，中性樹膠封片，即可獲得一套長爪沙鼠尼氏染色圖譜。通過比小鼠腦圖譜(http：//atlas.brain-map.org/atlas#atlas=1&plate)和長爪沙鼠尼氏染色后的腦片，即可得到各腦區(qū)解剖結(jié)構(gòu)和相對位置的信息，為了保證腦圖譜的完整性，可多做幾套圖譜防止缺片漏片。

2.2 立體定位方法

2.2.1 固定

嚙齒動物的左右腦基本對稱，而且顱骨具有明顯的解剖學(xué)標(biāo)志(圖1-C)。麻醉長爪沙鼠后，將耳桿從左右兩側(cè)插入外耳道，于主框固定(圖1-A)，使鼠腦左右高度一致。調(diào)節(jié)“壓環(huán)旋鈕”使壓環(huán)上移，將嚙齒動物的門齒固定于腦定位儀的上頜固定器；調(diào)節(jié)“固定旋鈕”使得嚙齒動物的頭部自然伸展，后旋緊固定；下壓“壓環(huán)按鈕”，夾緊頭部(圖1-B)。完成后對已固定好的長爪沙鼠腦袋進(jìn)行推壓，保證其從各個方向受力后均不發(fā)生偏移與滑脫。

2.2.2 校準(zhǔn)頭顱位置

在手術(shù)顯微鏡下定前囟(人字縫與矢狀縫的交點(diǎn))為主要基準(zhǔn)點(diǎn)，后囟(矢狀縫與冠狀縫的交點(diǎn))為輔助基準(zhǔn)點(diǎn)(圖1-C)，兩囟水平高度一致，并將前囟作為原點(diǎn)(0，0，0)。前后囟連接線即為Y軸，以向后為正；Z軸為豎直方向，以向上為正；X軸垂直于矢狀平面，以向右為正。

2.2.3 確定腦區(qū)空間坐標(biāo)

固定長爪沙鼠后剃毛，用2%碘伏和75%酒精充分消毒頭頂部，沿矢狀縫作長切狀剪開，充分暴露骨縫，3%雙氧水清除骨膜后用四棱鉆鉆開顱骨前囟位置，暴露腦膜，將腦膜挑破再垂直向主要基準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)針1 cm。針刺成功后立即將長爪沙鼠麻醉斷頭取腦，快速液氮冷凍，再行200 μm冠狀面切片，按順序貼片。以有進(jìn)針痕跡最明顯的腦片作為原點(diǎn)所在的切片。

對照尼氏染色圖譜及原點(diǎn)所在切片，大致推算目標(biāo)腦區(qū)的三維坐標(biāo)數(shù)據(jù)。數(shù)出目標(biāo)腦區(qū)腦片與原點(diǎn)所在腦片相差片數(shù)，片數(shù)乘以200 μm即得X值；然后利用標(biāo)尺在染色圖譜上測得目標(biāo)腦區(qū)與中線垂直距離為Y值；目標(biāo)腦區(qū)與原點(diǎn)所在水平面垂直距離加上顱骨厚度即為Z值。根據(jù)此坐標(biāo)數(shù)據(jù)再次對第二只長爪沙鼠進(jìn)針，后續(xù)重復(fù)上述操作，清點(diǎn)出目標(biāo)腦區(qū)所在腦片(圖1-D)與該腦片之間偏差的片數(shù)，并將腦片數(shù)×200 μm以得出所需腦區(qū)的準(zhǔn)確軸數(shù)據(jù)。根據(jù)針痕用標(biāo)尺測量，對X軸值和Z軸值進(jìn)行微調(diào)，得出目標(biāo)腦區(qū)最終的精確坐標(biāo)。最后用第3只鼠再次重復(fù)以驗證目標(biāo)腦區(qū)坐標(biāo)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

圖1 長爪沙鼠腦立體定位的主要步驟Fig.1 The main steps of stereotaxic localization of Meriones unguiculatus brain 注：A：固定外耳道附近的腦顱骨；B：固定長爪沙鼠的鼻端；C：長爪沙鼠腦顱骨暴露后的解剖形態(tài)，Ⅰ為前囟點(diǎn)Ⅱ為后囟點(diǎn)；D：帶有進(jìn)針痕跡的側(cè)腦室腦區(qū) Note：A，fixes the skull near the external auditory canal.B，fixes the nasal end of Meriones unguiculatus.C，fixes the anatomical morphology of Meriones unguiculatus skull after exposure.I，the anterior fontanel point，II，the posterior fontanel point.D，the lateral ventricle brain area with needle insertion marks

3 結(jié)果

利用上述方法對長爪沙鼠5個腦區(qū)進(jìn)行定位，左右兩側(cè)側(cè)腦室(LV)，終紋床核(BST)，室旁核(PVH)，杏仁核內(nèi)側(cè)核(MeA)，中央杏仁核(CeA)，共101例實驗結(jié)果(1只鼠可定位多個不同目標(biāo)腦區(qū))。LV定位65例，成功62例；BST腦區(qū)定位15例，成功13例；PVH腦區(qū)定位5例，成功5例；MeA腦區(qū)定位10例，成功9例；CeA腦區(qū)定位6例，成功6例，成功率達(dá)94.06%。

表1 以長爪沙鼠前囟所對應(yīng)腦表面為原點(diǎn)所得出目標(biāo)腦區(qū)定位坐標(biāo)(平均值)

4 討論

目前我國神經(jīng)功能障礙的患者人數(shù)眾多，發(fā)病率逐年攀升，然而，在疾病早期癥狀特異性低，極易漏診、誤診，有效治療手段十分有限，需要研究者更深入了解大腦的結(jié)構(gòu)功能及大腦發(fā)育、發(fā)展和退化規(guī)律以改變目前的窘境。而腦立體定位技術(shù)被視為研究中樞調(diào)控系統(tǒng)的重要前提和基礎(chǔ)。

同一物種各腦區(qū)在發(fā)育不同階段的解剖結(jié)構(gòu)會有偏差，導(dǎo)致目標(biāo)腦區(qū)坐標(biāo)發(fā)生變動，如老齡鼠通常會有不同程度的腦萎縮，較年輕個體神經(jīng)元面積減少6%—48%[12]，此外，性別因素對某些目標(biāo)腦區(qū)的坐標(biāo)定位也有影響，比如研究發(fā)現(xiàn)在前腹側(cè)室周核和視前區(qū)性雙形核等腦區(qū)結(jié)構(gòu)具有明顯的性別差異[12-14]。因此在進(jìn)行腦區(qū)定位時需將年齡、性別納入考慮因素。小型嚙齒動物頭骨形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，均有前后囟，左右對稱的耳道及突出的門齒。本實驗操作方案不僅能對沙鼠目標(biāo)腦區(qū)進(jìn)行有效定位，同樣還適用于其他各類小型嚙齒動物。通過本文操作流程，可根據(jù)待研究物種的性別、體重、日齡制作出一套相應(yīng)的腦區(qū)圖譜以實現(xiàn)對活體目標(biāo)腦區(qū)的精準(zhǔn)定位，避免因無關(guān)因素引起腦區(qū)定位偏差。

在整個實驗過程中，頭部的正確固定是腦立體定位成功的基礎(chǔ)，左右耳孔夾持器插入過深會損壞中耳結(jié)構(gòu)，插入不當(dāng)則會使頭部在實驗中途發(fā)生移動而導(dǎo)致實驗失敗。對新手而言耗時較長。理想的頭部固定應(yīng)是將其從各個方向受力后均不發(fā)生偏移與滑脫，保證長爪沙鼠顱骨處于水平狀態(tài)且前后囟要大致處于同一水平線。總體而言，本定位方案對儀器設(shè)備等實驗室條件要求相對不高，操作步驟簡單，成功率高，能有效減少動物使用量。在神經(jīng)科學(xué)中將腦立體定位技術(shù)與藥物微量注射[15-17]、損毀[18-19]光遺傳學(xué)等技術(shù)[20]相結(jié)合，有助于更好地促進(jìn)精神疾病動物模型研究。但此方法采用豎直向下進(jìn)針，適用于進(jìn)針路徑無重要血管結(jié)構(gòu)及生命中樞的目標(biāo)腦區(qū)，否則需要通過一定角度進(jìn)針，該方式還有待深入探討。

致謝：湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院陳佳欣、王曉彤同學(xué)協(xié)助操作，特此致謝。