馬 婭，馬麗娜，史俊杰，焦林宏，王紅玉

(蘭州石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730060)

牛奶因其營養(yǎng)成分齊全、營養(yǎng)價值高、易消化吸收等特點，被譽為“食品之王”，逐漸成為人們生活中不可或缺的一種食品。然而，奶牛飼養(yǎng)中為預(yù)防疾病常在飼料中添加抗生素，服用大劑量抗生素藥物，獲得的奶品中添加抗生素防止其腐壞[1]，這些因素均會導(dǎo)致抗生素在牛奶中殘留，長期飲用含抗生素殘留的牛奶不僅危害人類的健康, 同時由于抗生素對發(fā)酵乳中發(fā)酵菌種的繁殖產(chǎn)生抑制作用使其發(fā)酵異常從而影響奶制品的品質(zhì)[2]。

世界衛(wèi)生組織(WHO)在1979年就已經(jīng)將抗生素列為污染物，之后各個國家都開始關(guān)注牛奶中抗生素殘留檢測，提出了不應(yīng)檢出抗生素的要求。 2001年中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準也規(guī)定了無公害食品-生鮮牛乳中不能檢出抗生素。我國農(nóng)業(yè)部在2001年10月發(fā)布實施了《無公害食品生鮮牛乳行業(yè)標準》，明確規(guī)定“新鮮牛乳中抗生素不得檢出”。2002年發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定，奶中最高允許殘留量(單位ng/L)標準是：新霉素為500；慶大霉素為200；林可霉素為150；四環(huán)素、土霉素、磺胺類等均為100[3]。但目前為止我國乳制品中抗生素殘留量超標的現(xiàn)象仍然普遍存在。2002年，馬群飛等[4]對福建省幾個城市的生牛乳中抗生素殘留情況作了調(diào)查，調(diào)研發(fā)現(xiàn)尤溪市、晉江市、福州市和龍巖市所采集的生牛奶樣品中，抗生素陽性率分別為50%、25%、19.5%和9.7%。在2006年[5]，在我國的一些大城市(西寧、南寧、北京等)進行了奶制品質(zhì)量調(diào)研，結(jié)果顯示不合格項目中，抗生素殘留位居第一。目前乳制品中抗生素殘留的問題不可小覷，為保障使用乳品的安全和衛(wèi)生，相關(guān)部門須加強管理且嚴格檢測。牛乳中抗生素殘留的常用的檢測方法有：微生物檢測法、理化檢測法和免疫法。

1 微生物檢測法[6]

微生物檢測法也叫微生物抑制試驗(Migration Inhibition Test)可以定性或定量的測定牛乳中抗生素殘留量，基于某些抗生素能夠?qū)ξ⑸锏纳頇C能及繁殖代謝的抑制作用。微生物檢測法的基本原理，若存在抗生素會抑制牛奶中培養(yǎng)過微生物的繁殖生長，培養(yǎng)基不會出現(xiàn)渾濁，指示劑的顏色也不會發(fā)生變化。微生物檢測因其檢測價格低廉、檢測過程簡捷、檢測結(jié)果可靠等特點，是牛乳中抗生素殘留檢測的一種廣泛且經(jīng)典的方法。常用的微生物檢測法有：紙片法(PD法)、TTC 法、牛乳活性檢測法等。

1.1 紙片法

常用的紙片法：枯草桿菌法、嗜熱脂肪芽孢桿菌法。兩種方法的檢測過程基本一樣，均選用不同的菌種檢測牛乳中的青霉素(或β內(nèi)酰胺類抗生素)。在培養(yǎng)基上接種菌種(枯草桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌)，放入吸滿被檢乳品的圓形濾紙片，然后放入一張對照圓紙片，該紙片是含有標準抗生素的陽性紙片。若牛乳中無抗生素，微生物的繁殖生長，濾紙圓片不形成無抑菌圈，為陰性。反之，牛乳中存在抗生素或者抑菌物質(zhì)，紙片上形成抑菌圈，為陽性。為了確定測定結(jié)果非假陽性及陽性物質(zhì)是青霉素(或β內(nèi)酰胺類抗生素)，加熱乳品并加入青霉素酶測定，沒有抑菌圈說明奶品中存在青霉素(或β內(nèi)酰胺類抗生素)。如果仍出現(xiàn)抑菌圈，說明其他化合物導(dǎo)致了抑菌作用。但是當(dāng)抑菌圈變小且沒完全消失，說明不止一種抑菌化合物存在于奶樣中。該檢測方法的檢測限為 0. 01 IU /mL。

1.2 嗜熱鏈球菌抑制法(TTC法)

我國于2008年頒布并實施了《鮮乳中抗生素殘留檢測》國家標準(GB4789.27-2008)，該標準規(guī)定鮮乳中抗生素殘留的檢驗方法：嗜熱鏈球菌抑制法(TTC)和嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法。這兩種方法檢測過程基本一致，均可測定牛奶中抗生素的殘留量。

TTC檢測過程如下：乳品經(jīng)80℃的殺菌后，添加菌種(嗜熱鏈球菌)，培養(yǎng)一段時間菌種生長繁殖，加入TTC，該樣品中不含抗生素或抗生素含量低于檢測值，菌種繼續(xù)增殖，指示劑TTC被還原成紅色。相反，如果樣品中抗生素含量高于檢出值，抗生素抑制菌種繁殖，TTC不被還原，保持無色。該方法測定幾種抗生素的最低檢出量如表1所示。

表1 TTC檢測方法測定幾種抗生素的最低檢出量

1.3 牛乳活性檢測法

向乳品中加入適量發(fā)酵劑，發(fā)酵后乳品的pH值降低，牛乳中若有抗生素殘留，則發(fā)酵劑的繁殖被抑制，pH值的變化不大。牛乳活性檢測法過程：取適量的牛奶進行一段時間的加熱滅菌，然后迅速冷卻降至42℃后，加入發(fā)酵劑，經(jīng)攪拌后測pH值，一般在6.4左右。再將樣品于42℃保溫培養(yǎng)一段時間，每30 min 檢測1次pH值，測定三次。檢測過程中，90 min內(nèi)乳品的pH值下降至5.7，屬正常的發(fā)酵活性實驗，代表乳品呈陰性，無抗生素殘留。如果3次檢測結(jié)果的pH值不變均在 5.7以上，表明存在抗生素，為陽性。據(jù)研究乳品中抗生素殘留量達到 0.015～0.05 U/mL之間時，會抑制菌類的發(fā)酵速度，因而需借助做小樣的辦法確定是否抗生素殘留。

2 理化檢測法

理化檢測法特點是：高分離效率、高靈敏度、穩(wěn)定可靠的測定結(jié)果等，是牛奶中抗生素殘留量確定的一種精確檢驗方法。該方法對樣品進行一定處理之后要借助實驗室的精密儀器測定抗生素的含量。雖然這種方法具有很高的精確度，但是該檢測方法對檢測樣品的前處理比較復(fù)雜。常用的理化檢測方法：高效液相色譜法(HPLC)和色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。

2.1 高效液相色譜法

高效液相色基于氣相色譜理論通過高壓泵、高效固定相及高靈敏檢測器等設(shè)備，快速、高效、自動化檢測牛乳中抗生素殘留量，是廣泛使用的一種理化檢測方法。高效液相色譜法測定步驟比較復(fù)雜，包括樣品處理、殘留抗生素分離和檢測。

樣品處理步驟：樣品提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等。樣品提取常用的提取試劑是水和酸化有機溶劑，脫除樣品中的蛋白和萃取殘留。加拿大HAL用鎢酸鈉、硫酸和水提取組織中青霉素同時并脫掉蛋白質(zhì)，對牛乳中的青霉素脫除效果非常好。樣品提取后可采用一些有機溶劑、無機酸及超濾法進行蛋白質(zhì)沉淀。為減少非極性物質(zhì)的污染，Bioson等用硫酸和鎢酸鈉把青霉素萃入水相，得到較為干凈的水提取液。一般來說，萃取得到的水或有機提取液中待測物濃度低，而且含有一些共萃取物導(dǎo)致無法準確測定痕量目標物，因為共萃取物會損害儀器，增加檢測噪音。為避免出現(xiàn)以上問題，需要對待測物進行凈化與濃縮。常用的凈化和濃縮方法：免疫親和色譜法、離子交換法和固相萃取法。

殘留組分的分離方式主要包括正相、反相和離子交換三種方式。反相高效液相色譜法具有短時、高效且可在水系統(tǒng)中完成的優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用。殘留抗生素被分離后，使用紫外檢測器或熒光檢測器檢測。紫外檢測器價格低、選擇性好的特點，能滿足抗生素殘留的檢測要求。但是如瓶中抗生素含量低，背景干擾比較嚴重，常采用柱前或柱后的衍生反應(yīng)來提高其靈敏度。彭莉采用HPLC法測定了牛奶中氯霉素的殘留量，通過簡單的樣品前處理，達到了較高的回收率(平均回收率94.8%)，而且檢測結(jié)果精密度高，可作為牛奶中氯霉素殘留檢測的方法。

2.2 色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法

色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法是牛乳中抗生素殘留分析檢測的趨勢，常用的色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法：薄層色譜/質(zhì)譜法(TLC/MS)、氣相色譜/質(zhì)譜法(GC/MS)、液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)、液相色譜/核磁共振法(LC/NMR)、超臨界流體/質(zhì)譜法(SFC/MS)等。液相 /質(zhì)譜(LC/MS)聯(lián)用法用液相色譜實現(xiàn)樣品的有效分離，提供保留時間，用質(zhì)譜儀分析液相色譜儀的不同洗脫成分，完成定性和定量分析。色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法具有高效、可靠、高通量等特點，可以同時完成分離、定性及定量檢測，廣泛應(yīng)用于確證性分析。然而由于色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法所用儀器價格貴，檢測費用高，遠不如HPLC法普及。

3 免疫法[8]

免疫法因其具有檢測所需樣品量少、檢測速度快、分析費用少、靈敏度高等特點被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場監(jiān)控和篩選樣品。免疫分析法是抗原、半抗原及抗體發(fā)生特異性的結(jié)合，即抗原/抗體免疫反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上進行的生化檢測方法。目前免疫檢測法分為兩大類：(1)相對獨立的免疫檢測法，如放射免疫標記技術(shù)(RIA)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等；(2)聯(lián)用法，將免疫技術(shù)和其他理化檢測技術(shù)(如氣相色譜、液相色譜)相結(jié)合測定抗生素殘留，典型測定方法：免疫親合色譜(IAC)。免疫法具有高選擇性、高靈敏度可以用來凈化氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)的樣品，色譜技術(shù)檢測效快速、檢測結(jié)果準確，將兩種方法相結(jié)合能達到分析過程簡捷、分析成本低廉，待測物范圍廣的目的。目前，磺胺類、鏈霉素類、內(nèi)酰胺類、喹諾酮類以及四環(huán)素類等抗生素已經(jīng)建立了免疫測定法。

最常用的免疫技術(shù)是ELISA法，固相載體表面吸附已知的抗原或抗體與酶標記的抗原或抗體反應(yīng)，通過酶與催化底物顯色測定待測物含量。常用的標記酶：即辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)。ELISA法具有高靈敏度、強特異性、低檢測費用、快檢測速度、低毒性等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于奶牛養(yǎng)殖場和奶制品生產(chǎn)企業(yè)中抗生素的快速篩查檢測方法。ELISA法能完成40個以上樣品同一種或一類抗生素的測定，此法對結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì)存在交叉反應(yīng)，無法準確測定小分子及穩(wěn)定性差的物質(zhì)。因此，為防止假陽性結(jié)果，ELISA法篩查后的陽性樣品，還需采用其他理化檢測方法確證。

4 我國在牛奶中抗生素使用的檢測方法及現(xiàn)狀

目前我國在生產(chǎn)管理上常用的抗生素殘留篩查檢測方法主要有TTC法和SNAP法(又稱雙流向酶聯(lián)免疫技術(shù))。國標TTC法可同時測定幾種能抑制菌種生長抗生素含量在國內(nèi)雖應(yīng)用廣泛但因其檢測時間長、操作復(fù)雜、不易標準化而受到局限。SNAP法獲美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認可，利用酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體的免疫反應(yīng)，在幾分鐘能快速檢出牛奶中的β-內(nèi)酰胺類抗生素，敏感性高、特異性好，但是SNAP法需要購買專門的試劑和試劑和儀器，導(dǎo)致其檢測成本增加。針對該問題，目前國內(nèi)專家和學(xué)者都在積極研制基于TTC法快速檢測試紙檢測技術(shù)。

快速檢測試紙法操作過程簡單、檢測速度快、攜帶方便是乳制品中抗生素殘留篩查的發(fā)展趨勢?？焖贆z測試紙使用時，將牛乳滴加或者浸入試紙，在幾分鐘內(nèi)檢測出牛乳中是否含有殘留抗生素。這種檢測方法一般用于其他測試之前，作為快速篩查測試，當(dāng)顯示結(jié)果為陽性需要采取其他新的測試。2019年[10]劉廣源等以TTC法為基礎(chǔ)，研制了一種能快速檢測牛乳中氯霉素殘留的試紙，對牛奶中氯霉素的殘留進行快速，有效的檢測。目前，該方法還處于實驗室的研究階段，它的進一步開發(fā)及商業(yè)應(yīng)用還需要很長一段時間。