蔣雨薇,張梓卉,曾銘華,黨小紅,劉習(xí)明,張 妍

(長(zhǎng)沙生殖醫(yī)學(xué)醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410205)

卵泡細(xì)胞反映了卵母細(xì)胞的整體健康狀況以及胚胎的后續(xù)發(fā)育能力。顆粒細(xì)胞與單個(gè)卵母細(xì)胞相關(guān)的生物標(biāo)志物可用于輔助生殖預(yù)測(cè)何種胚胎最有可能植入子宮并完成妊娠。本綜述中，我們對(duì)近年來涉及胚胎發(fā)育和妊娠有關(guān)的人卵泡顆粒細(xì)胞生物標(biāo)志物進(jìn)行了匯總，對(duì)其微陣列數(shù)據(jù)和定量RT-PCR驗(yàn)證表達(dá)基因的研究進(jìn)行了評(píng)估，提示顆粒細(xì)胞生物標(biāo)記物有助于識(shí)別成熟卵母細(xì)胞以期提高妊娠和活產(chǎn)率。

在過去三十年中我國(guó)輔助生殖技術(shù)雖然有所改進(jìn)，但不孕患者妊娠率和活產(chǎn)率仍不理想。對(duì)于未來的發(fā)展，提高胚胎選擇及植入率是提高生育治療效率的關(guān)鍵。使用激素療法來誘導(dǎo)排卵以及其他用于生產(chǎn)胚胎的技術(shù)包括IVF、ICSI、IMSI及捐贈(zèng)卵子等改進(jìn)的空間不大。缺乏客觀、準(zhǔn)確和無創(chuàng)的胚胎評(píng)估策略仍然是體外受精面臨的主要挑戰(zhàn)之一。隨著胚胎發(fā)展實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)及PGD/PGS技術(shù)的出現(xiàn)，胚胎選擇成為生育治療最有發(fā)展前景的領(lǐng)域。顆粒細(xì)胞反映了卵母細(xì)胞的特性，為評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量提供了一種無創(chuàng)手段。近年來，應(yīng)用qRT-PCR和微陣列技術(shù)，一些研究將顆粒細(xì)胞基因表達(dá)的變化與胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局聯(lián)系起來。本綜述主要評(píng)估卵泡顆粒細(xì)胞的生物標(biāo)志物來預(yù)測(cè)選擇胚胎以期提高體外受精妊娠的成功率。

1 顆粒細(xì)胞生物標(biāo)志物篩選

卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間縫隙連接和旁分泌通訊的相互作用系統(tǒng)為卵母細(xì)胞的發(fā)育、排卵、受精和隨后的植入創(chuàng)造了最佳條件。目前的研究擬用顆粒細(xì)胞的基因表達(dá)譜識(shí)別產(chǎn)生高質(zhì)量胚胎的卵母細(xì)胞，以非侵入性的方式準(zhǔn)確地反映卵母細(xì)胞的生育潛能。顆粒細(xì)胞基因標(biāo)志物的研究選擇有不同端點(diǎn)，包括卵母細(xì)胞核成熟期、受精期、第2～3天胚胎期、第5～6天囊胚期、著床期、妊娠和活產(chǎn)期，并根據(jù)妊娠結(jié)局確定胚胎質(zhì)量和能力。迄今發(fā)表的研究表明，qRT-PCR作為一種敏感和有效的方法，廣泛應(yīng)用于單個(gè)轉(zhuǎn)錄樣本的定量。另一方面，利用微陣列技術(shù)進(jìn)行全基因組表達(dá)譜分析，為研究人員開辟了一個(gè)新的視角，有望鑒定出可行胚胎的轉(zhuǎn)錄標(biāo)志。

2 顆粒細(xì)胞標(biāo)記物與卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育相關(guān)的微陣列及qRT-PCR分析

卵母細(xì)胞的發(fā)育能力是其恢復(fù)成熟、成功受精和達(dá)到囊胚期的能力。這種能力是通過與卵泡的體細(xì)胞相互作用而獲得的。卵丘和顆粒細(xì)胞支持卵母細(xì)胞的發(fā)育，而卵母細(xì)胞則影響卵泡細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。研究表明，卵泡刺激素和黃體生成素通過蛋白激酶A(PKA)和C(PKC)在顆粒細(xì)胞中啟動(dòng)信號(hào)，在卵母細(xì)胞能力獲得中起重要作用。Tremblay PG等采用基因芯片和RT-qPCR技術(shù)，觀察PKA和PKC刺激對(duì)顆粒細(xì)胞瘤基因表達(dá)的影響[1]。蛋白激酶驅(qū)動(dòng)的信號(hào)涉及五個(gè)主要的上游調(diào)節(jié)，即表皮生長(zhǎng)因子(EGF)[2]，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)[3]、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)[4]，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF 2)[5]和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)[6]。與7種主要卵巢功能相關(guān)的基因有：炎性反應(yīng)[7-8]包括前列腺素內(nèi)切酶2(PTGS2)，白細(xì)胞介素8(IL-8)和白細(xì)胞介素6(IL-6)；類固醇生成[9-11]包括立體致敏的急性調(diào)節(jié)蛋白(STAR)、細(xì)胞色素P450家族11亞家族A成員1(CYP11A1)，以及細(xì)胞色素P450家族19亞家族A成員1(CYP19A1)；血管生成[12-14]包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGFC)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)和血管生成C-X-C趨化因子受體四型(CXCR 4)；分化[15-16]包括表皮生長(zhǎng)因子(AREG)，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和RTK信號(hào)拮抗劑2(SPRY 2)；細(xì)胞凋亡[17-19]包括BCL 2相關(guān)聯(lián)X(bax)，bcl-樣蛋白12(Bcl2L12)和半胱天冬酶1(CASP 1)；基質(zhì)[20-21]包括細(xì)胞周期蛋白D1(CCND 1)，細(xì)胞周期蛋白B1(CCNB 1)，細(xì)胞周期蛋白B2(CCNB 2)；排卵[22-23]包括金屬蛋白酶1(MMP1)、金屬肽酶9(MMP 9)和TIMP金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP 1)。

在研究顆粒細(xì)胞基因表達(dá)與體外胚胎發(fā)育的關(guān)系的研究中，McKenzie等人評(píng)估了在108個(gè)人卵泡顆粒細(xì)胞中與卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎質(zhì)量相關(guān)的HAS2、PTGS2和GREM1[24-27]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTGS2和HAS2在發(fā)育為高級(jí)別胚胎的卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)增加了6倍，GREM1的表達(dá)增加了15倍。應(yīng)用qrt-PCR技術(shù)，對(duì)單個(gè)卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞在卵母細(xì)胞中顯著表達(dá)PTGS2。van Montfoort等人進(jìn)行了基因芯片實(shí)驗(yàn)，比較了8個(gè)卵子早期卵裂胚胎和8個(gè)非早期卵裂胚胎卵母細(xì)胞中的基因表達(dá)[28]，結(jié)果顯示，共有611個(gè)基因有差異表達(dá)，這些基因參與了許多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞周期、血管生成和凋亡等。在已鑒定的基因中，細(xì)胞周期蛋白D2(CCND 2)[29]、趨化因子受體4(CXCR 4)[14]、谷胱甘肽過氧化物酶3(GPX 3)[30]、鈣黏素相關(guān)蛋白1(CTNND 1)[31]、7-脫氫膽固醇還原酶(DHCR 7)[32]、紊亂節(jié)段極性蛋白3(DVL 3)[33]、熱休克27 kDa蛋白1(HSBP 1)[34]和三重基序28(TRIM 28)[35]是qrt-PCR分析證實(shí)的最重要的基因。這些基因表達(dá)的改變被認(rèn)為是非早期卵裂胚胎缺氧狀態(tài)或卵母細(xì)胞成熟延遲的標(biāo)志。隨后，Assou等人提出了一種基于微陣列基因表達(dá)譜的比較[36]，從而獲得了630個(gè)差異表達(dá)基因研究的鑒定結(jié)果。經(jīng)qRT-PCR證實(shí)bcl-樣蛋白11(BCL2L11)[37]和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(PCK 1)[38]表達(dá)上調(diào)，核因子IB(NFIB)[39]表達(dá)下調(diào)。這些基因有較高的表達(dá)水平，提示顆粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活對(duì)胚胎的發(fā)育能力至關(guān)重要。以上結(jié)果表明顆粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析有助于識(shí)別卵母細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)，可能作為新的無創(chuàng)標(biāo)記而替代入侵診斷試驗(yàn)的方法。

3 顆粒細(xì)胞標(biāo)記物與妊娠能力相關(guān)的微陣列及qRT-PCR分析

在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，應(yīng)考慮基因表達(dá)分析，以確定可能導(dǎo)致妊娠的卵母細(xì)胞[40]。Hamel等人的三項(xiàng)連續(xù)研究報(bào)告了妊娠結(jié)局與顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄體之間的關(guān)系[41-43]。在其研究中，使用cDNA微陣列和基因芯片，對(duì)顆粒細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了分析。從代表孕婦和非孕婦患者的集合樣本中提取的消減文庫(kù)中提取定制微陣列包含顆粒細(xì)胞表達(dá)的序列標(biāo)簽(EST)。在115個(gè)差異表達(dá)基因中，3-β-羥色胺脫氫酶(HSD 3β1)[44]的表達(dá)發(fā)生了改變，鐵氧還蛋白1(FDX 1)[45]，絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制劑類成員2(SERPINE2)[46]、細(xì)胞色素P450芳香化酶(CYP19A1)[11]和細(xì)胞分裂周期42(CDC42)[47]與妊娠結(jié)局顯著相關(guān)。利用這項(xiàng)初步研究的結(jié)果，研究人員隨后確定了磷酸甘油酸激酶1(PGK 1)[48]、G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子(RGS 2、RGS 3)[49-50], CDC42和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2(UGP 2)[51]以及血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源結(jié)構(gòu)域A族成員1(PHLDA 1)[52]，作為與胚胎質(zhì)量相關(guān)致妊娠成功的潛在標(biāo)記。

綜上所述，與卵母細(xì)胞相關(guān)的顆粒細(xì)胞是鑒定生物標(biāo)志物的有價(jià)值的來源，從而可靠地選擇能夠?qū)е禄町a(chǎn)的胚胎。在評(píng)估顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄學(xué)的研究中所發(fā)表的結(jié)果顯示，對(duì)顆粒細(xì)胞作為卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育和質(zhì)量標(biāo)記物的共識(shí)是有限的。這可能是由于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、研究結(jié)果指標(biāo)、研究群體的規(guī)模和利用技術(shù)的變化造成的。此外，在評(píng)估卵泡顆粒細(xì)胞有關(guān)胚胎質(zhì)量和其他生殖終點(diǎn)的微陣列和qRT-PCR數(shù)據(jù)時(shí)，主要的困難之一是患者群體的異質(zhì)性。影響體外受精結(jié)局和基因表達(dá)的患者特征包括年齡、體重指數(shù)(BMI)、診斷、刺激類型、刺激過程中的激素水平和卵母細(xì)胞產(chǎn)量等，因此選擇患者是鑒別顆粒細(xì)胞預(yù)測(cè)妊娠的生物標(biāo)記物的關(guān)鍵。由于IVF患者在尋找潛在的生物標(biāo)志物時(shí)要考慮許多不同的特點(diǎn)，逐步多因素分析可能是選擇子宮移植胚胎最有希望的方法。雖然許多研究都集中在授精成熟卵母細(xì)胞的結(jié)果上，但在子宮移植時(shí)并不能保證被評(píng)估的胚胎在基因上是正常的。顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄與植入前遺傳篩查PGS的結(jié)合可能是改善子宮移植胚胎選擇的下一步，因?yàn)檫@將認(rèn)可胚胎倍性狀態(tài)及基因表達(dá)生物標(biāo)志物與活產(chǎn)的關(guān)系。顆粒細(xì)胞生物標(biāo)志物也可能有更多的應(yīng)用，鑒于許多成熟卵母細(xì)胞在形態(tài)上相似，顆粒細(xì)胞生物標(biāo)記物有助于識(shí)別成熟卵母細(xì)胞。在將來，顆粒生物標(biāo)志物可能會(huì)在卵母細(xì)胞受精之前進(jìn)行評(píng)估，只選擇那些能夠?qū)е禄町a(chǎn)的卵母細(xì)胞去受精，以期提高妊娠和活產(chǎn)率。