曾曉丹，趙 影，馬明碩，金 星

（吉林化工學(xué)院分析測(cè)試中心，吉林 吉林 132022）

萘酰亞胺屬于具有大平面的芳香性雜環(huán)化合物，研究表明它可通過插入或溝槽結(jié)合，與雙鏈DNA發(fā)生作用，從而影響到DNA 的復(fù)制，進(jìn)而阻斷細(xì)胞的分裂過程，因此具有良好的抗腫瘤活性，是醫(yī)學(xué)中常被用來作為藥物開發(fā)的一類物質(zhì)[1]。1,8-萘酰亞胺的Stocks 位移較大，吸收和熒光峰型都比較寬，作為熒光基團(tuán)用來進(jìn)行結(jié)構(gòu)調(diào)整相對(duì)比較簡(jiǎn)單[2]，因此常作為熒光基團(tuán)被各種熒光探針采用。

血清白蛋白是生物體內(nèi)血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，參與了生物體內(nèi)許多重要生理功能，比如維持血清的正常pH 值和血漿膠體滲壓。同時(shí)血清白蛋白具有可與許多內(nèi)源和外源性物質(zhì)結(jié)合的特點(diǎn)，是物質(zhì)在體內(nèi)運(yùn)輸?shù)闹匾d體[3]。因此，經(jīng)常通過研究小分子物質(zhì)與血清白蛋白的相互作用，來闡明物質(zhì)在體內(nèi)的運(yùn)輸及分布情況。

本課題組自主設(shè)計(jì)了用于識(shí)別生物體內(nèi)ClO-的熒光探針 ZZY-19 (圖1)，并成功應(yīng)用于細(xì)胞成像研究。為了進(jìn)一步了解探針如何在體內(nèi)運(yùn)輸與分布，從分子水平上解釋與驗(yàn)證探針的識(shí)別機(jī)理，為探針良好的選擇性識(shí)別提供更多的信息，以便為設(shè)計(jì)出更多靈敏度高、選擇性好的探針，以及進(jìn)行結(jié)構(gòu)調(diào)整提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持，本文采用熒光光譜法測(cè)定了 ZZY-19 與 HSA 之間的結(jié)合常數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)等，通過同步熒光光譜和紫外光譜，研究?jī)烧呓Y(jié)合前后HSA 構(gòu)象的變化，進(jìn)一步揭示ZZY-19 與HSA之間可能存在的相互作用，為最終闡明ZZY-19 的識(shí)別機(jī)理提供一系列分子相互作用的信息。

圖1 探針ZZY-19 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The moleuclar structure of ZZY-19

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

HSA，配制成濃度為10-5mol·L-1儲(chǔ)備液，探針ZZY-19 用三氯甲烷配成10-3mol·L-1儲(chǔ)備液，Tris（10-2mol·L-1，pH=7.4）緩沖溶液。其他所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

熒光分光光度計(jì)，UV-2550 紫外分光光度計(jì)，pH 計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

移取適量的探針ZZY-19 儲(chǔ)備液、HSA 儲(chǔ)備液、乙醇溶液，以 pH=7.40 的Tris-HCl 緩沖溶液定容至3mL。HSA 的濃度為2 μmol·L-1，探針的濃度范圍為0～10 μmol·L-1，測(cè)定溶液的溶劑體系為乙醇∶水=1∶4（V/V）。將測(cè)定溶液搖勻靜置。

熒光光譜的測(cè)定：激發(fā)波長(zhǎng)為280nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5nm，掃描加入探針前后290～450nm 范圍內(nèi)HSA 的熒光光譜。

紫外吸收光譜的測(cè)定：以 Tris-HCl 緩沖溶液為參比，掃描加入探針前后200～400nm 范圍內(nèi)HSA的紫外吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 HSA 與ZZY-19 的紫外吸收光譜

測(cè)定了 HSA 加入不同濃度的探針 ZZY-19 前后的HSA 的紫外吸收光譜(圖2)。由圖2 可以看出，隨著探針 ZZY-19 濃度增加，HSA 在280nm 處的吸收強(qiáng)度隨之增大并發(fā)生藍(lán)移，表明HSA 與探針形成了復(fù)合物，改變了HSA 的微環(huán)境，不僅使HSA 的紫外吸收光譜發(fā)生了變化，也使HSA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化[4]。

圖2 探針ZZY-19 作用的HSA 紫外-可見吸收光譜Fig.2 The Uv-vis of HSA with the addtion of ZZY-19

2.2 HSA 與ZZY-19 的熒光光譜

HSA 內(nèi)部的 Trp、Tyr 和 Phe 殘基是HSA 主要的熒光來源，而Trp 殘基則是形成其內(nèi)源熒光的主要部分。由探針ZZY-19 對(duì)HSA 的影響(圖3)可見，隨著探針濃度增加，HSA 的熒光強(qiáng)度逐漸降低并伴隨著最大發(fā)射峰的藍(lán)移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針ZZY-19 與HSA 通過相互作用結(jié)合形成了復(fù)合物，這種結(jié)合改變了HSA 分子中氨基酸殘基的微環(huán)境。熒光猝滅可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅，兩種猝滅機(jī)制的主要區(qū)別在于猝滅常數(shù)與溫度的不同聯(lián)系。靜態(tài)猝滅常數(shù)往往隨溫度的升高而減小，而動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)則隨溫度的升高而增大。

在3 種不同的溫度條件下測(cè)定了HSA 的熒光數(shù)據(jù)，根據(jù)式(1)計(jì)算得到了Ksv 值和Kq 值(表1)。

圖3 不同探針ZZY-19 濃度條件下 HSA 的熒光光譜Fig. 3 The Fluorescence spectra of HSA with the different concentration of ZZY-19

由表1 可知，Ksv 值和Kq 值與濃度的線性關(guān)系良好。隨著溫度升高，猝滅常數(shù)減小，且Kq 值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1。由此可以推測(cè)，二者的猝滅機(jī)制來源于探針ZZY-19 與HSA 結(jié)合形成的靜態(tài)復(fù)合物，而不是由動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)制引起的[5]。同時(shí)，HSA 的最大發(fā)射峰稍有藍(lán)移，說明內(nèi)部環(huán)境的極性逐漸降低，進(jìn)一步證實(shí)了探針與HSA 之間存在相互作用[6]。

表1 不同溫度時(shí)的 HSA 探針ZZY-19 體系的Ksv 和Kq 值Table 1 The valuea of Ksv and Kq between HSA and ZZY-19 at different temperatures

2.3 HSA 與ZZY-19 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)的確定

根據(jù)靜態(tài)淬滅機(jī)制，如果蛋白質(zhì)中存在相似且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，則可根據(jù)公式(2) ，計(jì)算得到探針與HSA 的結(jié)合常數(shù)以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)[7]：

結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n的值大約為1 (表2)，表明每1 個(gè)HSA 分子能夠結(jié)合1 個(gè)探針ZZY-19 分子。

表2 不同溫度下的結(jié)合常數(shù)K 和結(jié)合位點(diǎn)數(shù) nTable 2 The values of K and n between HSA and ZZY-19 at different temperatures

2.4 HSA 與ZZY-19 的熱力學(xué)分析和結(jié)合力類型的確定

化合物和生物體內(nèi)蛋白質(zhì)分子間的結(jié)合力主要有4 種類型，即范德華力、氫鍵、靜電引力和疏水作用力。對(duì)熱力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析，可以得到探針ZZY-19 與HSA 之間的作用力類型。若焓變(ΔH)的變化在所研究的溫度范圍內(nèi)很小，則可將該反應(yīng)的焓變視作一個(gè)常數(shù)?？梢杂晒?3)計(jì)算得到焓變值(ΔH)和熵變值(ΔS)：

再由公式(4)計(jì)算得到結(jié)合反應(yīng)的自由能變：

從計(jì)算得到的熱力學(xué)函數(shù)值(表3)可以看出，ΔH＞0，ΔS＞0，表明探針ZZY-19 與HSA 的結(jié)合過程由疏水力占主導(dǎo)作用，另外由計(jì)算數(shù)據(jù)可知ΔG＜0，說明二者之間的結(jié)合可自發(fā)進(jìn)行[8]。

表3 ZZY-19 與HSA 結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters for the binding of ZZY and HSA

2.5 HSA 與ZZY-19 結(jié)合距離的確定

從F?rster 的非放射共振能量轉(zhuǎn)移理論，可以得到探針ZZY-19 與HSA 之間的結(jié)合距離。依據(jù)式(5)和式(6)，可計(jì)算得到ZZY-19 與HSA 之間的能量轉(zhuǎn)移效率E[9]：

其中，J是供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜之間的光譜重疊積分。通過式(7)得出：

通過計(jì)算可求得如下參數(shù)：J=2.128×10-15cm3·L·mol-1，R0=1.97 nm，r=2.56 nm，可 見 探 針ZZY-9 與HSA 殘基的作用距離r小于8nm，并且滿足0.5R0＜r＜1.5R0的關(guān)系。計(jì)算結(jié)果表明，二者的結(jié)合符合F?rster 能量轉(zhuǎn)移理論提出的條件，HSA與探針ZZY-19 之間的結(jié)合，是非輻射能量轉(zhuǎn)移，與靜態(tài)淬滅機(jī)制的發(fā)生機(jī)理完全符合。

3 結(jié)論

本文在體外生理?xiàng)l件下，應(yīng)用熒光光譜與紫外光譜，對(duì)探針ZZY-19 與HSA 的相互作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，疏水力在探針ZZY-19 與BSA 的結(jié)合中起主要作用，并且相互作用可以自發(fā)進(jìn)行。在相互作用的過程中，探針ZZY-19 可以插入到HSA的疏水腔中。從HSA 到探針ZZY-19 可以發(fā)生非放射性能量轉(zhuǎn)移，探針ZZY-19 與HSA 的結(jié)合距離約為2.56nm（298K）。本研究結(jié)果有助于了解探針ZZY-19 與HSA 的結(jié)合機(jī)制，更好地了解探針ZZY-19 對(duì)血液運(yùn)輸和分配過程中蛋白質(zhì)功能的影響。這些信息有助于探針ZZY-19 的識(shí)別開發(fā)和應(yīng)用。