羅希榕，覃 成，李清超，梁振娟，劉建新，楊 珊，宋志豪，蔡向西，張 林

(1.遵義職業(yè)技術(shù)學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)系，貴州 遵義 563006；2.遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院遵義市作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563006；3.畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，貴州 畢節(jié) 551700)

玉米是人類利用雜種優(yōu)勢最早、最廣泛、成效最顯著的作物。據(jù)FAO公布的數(shù)據(jù)(http://www.fao.org)，2018年世界玉米種植面積為16 827萬hm2，總產(chǎn)量104 050萬t，種植面積和產(chǎn)量分列農(nóng)作物的第二位和第一位；我國玉米年播種面積為3 544.5萬hm2，總產(chǎn)量為21 589萬t，種植面積和總產(chǎn)量均居農(nóng)作物的第一位。20世紀(jì)70年代后期，我國實(shí)現(xiàn)了玉米單交種的普及，大幅度地提高了玉米產(chǎn)量[1]。進(jìn)而玉米育種家開始大規(guī)模利用二環(huán)系法等常規(guī)育種技術(shù)手段選育自交系，以提高玉米雜交種的產(chǎn)量和抗病性。但該方法獲得高配合力的純合自交系通常需要經(jīng)過6～10代的自交選擇。近年來，單倍體育種技術(shù)已成為與分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)相媲美的現(xiàn)代玉米育種三大核心技術(shù)[2-5]。單倍體育種能顯著縮短育種年限，一般只需一代自交即可獲得純合自交系。1929年首次發(fā)現(xiàn)玉米單倍體[6]，1950年發(fā)現(xiàn)玉米單倍體誘導(dǎo)系Stock 6材料[7]，使玉米單倍體育種技術(shù)由設(shè)想變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。我國利用單倍體誘導(dǎo)選系開展較晚[8-10]，但取得了很大的進(jìn)展。我國育種家對美國學(xué)者Coe EH選育的單倍體誘導(dǎo)系Stock 6進(jìn)行了遺傳改良，劉志增等[11,12]將高油玉米群體BHO與單倍體誘導(dǎo)系Stock 6進(jìn)行雜交，通過對其后代進(jìn)行測交和選擇，育成了農(nóng)大高誘1號。這是我國第一個(gè)玉米孤雌生殖單倍體誘導(dǎo)系，結(jié)合了ABP 1紫色植株標(biāo)記和獨(dú)特的大胚面標(biāo)記，與Stock 6相比，其質(zhì)粒Navajo標(biāo)記更加明顯，平均單倍體誘導(dǎo)率(5.34%)是Stock 6的5倍。

本研究以農(nóng)大高誘1號作父本，進(jìn)一步從黔西北玉米不同種質(zhì)資源中篩選單倍體誘導(dǎo)率較高的合適母本，實(shí)現(xiàn)配子選擇，提高優(yōu)良基因型的入選頻率，用于選育綜合性狀好的純系，組配出更加高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的玉米新品種，為貴州省玉米品種的合理布局提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

孤雌生殖誘導(dǎo)系農(nóng)大高誘1號由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)放，216、405、02 H 58、13 H 199、E 28、木6、S 37、Y 054、Mo 17×B 73、T 32×R 273、W 260×612、畢單17、畢單18、昌7-2、昌7-2×K 12、木6×Mo 17、木6 X 82、齊319×沈137、齊319×18-599、沈137×掖478、地方種、鄭58×B 73等參試材料均由畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所引進(jìn)或經(jīng)過多年的田間選擇及構(gòu)建而來，所有供試材料中的雜交組合均為F3代種質(zhì)，試驗(yàn)材料包括墨白、蘭卡斯特、旅大紅骨、塘四平頭、蘇灣、瑞德、P群以及地方種等種質(zhì)資源，所有參試材料均種植于畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所畢節(jié)實(shí)驗(yàn)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1參試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參試材料父本選用中國農(nóng)業(yè)大學(xué)下發(fā)農(nóng)大高誘1號，母本選用國內(nèi)骨干自交系及畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育新材料，2013年春季將參試材料在畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)基地雜交，獲得F1代，同年在海南玉米基地自交獲得F2代相應(yīng)材料，2014年在畢節(jié)實(shí)驗(yàn)基地利用高誘1號作父本進(jìn)行雜交；自交系材料每個(gè)雜交5穗，雜交種每個(gè)處理10穗，2次重復(fù)。

1.2.2單倍體的誘導(dǎo)

用孤雌生殖誘導(dǎo)系農(nóng)大高誘1號作父本，以參試材料作母本，雜交誘導(dǎo)單倍體，從收獲的雜交種子中鑒定挑選單倍體。

1.2.3遺傳標(biāo)記鑒定

基于R-nj遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，以玉米籽粒的紫色糊粉層和紫色胚芽為顯性標(biāo)記。經(jīng)過孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)的玉米籽粒，紫色糊粉層及紫色胚芽的籽粒為正常雜交籽粒，紫色糊粉層加無色胚芽籽粒即為單倍體籽粒，其余籽粒為受花粉污染的正常雜交籽粒。將所選擇的準(zhǔn)單倍體籽粒精細(xì)播種于田間，根據(jù)R-nj基因控制的植株顏色鑒定單倍體植株[13]。

1.2.4形態(tài)學(xué)鑒定

在相同的管理?xiàng)l件下，單倍體植株與正常植株，形態(tài)差異較大，單倍體植株矮小，葉片較少、狹窄、直立，生長緩慢；一般正常雜交株株型高大，生活力較強(qiáng)，長勢較為旺盛，與一般雜交植株較為相似。將相應(yīng)單倍體籽粒經(jīng)過不同的加倍方法加倍處理后在育苗盤中育苗，然后移栽至田間，紫色植株為正常二倍體，綠色植株為單倍體植株。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用基于R-nj遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的籽粒初篩，然后用不同濃度的秋水仙素對相應(yīng)參試材料處理不同時(shí)間，每個(gè)處理2次重復(fù)；再將處理后的種子育苗移栽大田，再根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定出單倍體植株；數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)大高誘1號對不同種質(zhì)自交系單倍體誘導(dǎo)率的分析

由表1可見，9個(gè)自交系的單倍體平均誘導(dǎo)率為1.86%，誘導(dǎo)率最高的是5.54%(02 H 58)，其次為2.43%(木6)，最低的為0(Y 054)。對不同雜優(yōu)類群種質(zhì)自交系分析發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)率高低順序依次是P群、旅大紅骨、蘇灣、墨白、地方種、蘭卡斯特、塘四平頭?？梢?，農(nóng)大高誘1號對不同種質(zhì)自交系的誘導(dǎo)效率存在差異。

表1 農(nóng)大高誘1號對不同種質(zhì)自交系的誘導(dǎo)率

2.2 農(nóng)大高誘1號對不同雜交種質(zhì)單倍體誘導(dǎo)率的分析

由表2可看出，13個(gè)雜交種質(zhì)的單倍體平均誘導(dǎo)率為2.51%，誘導(dǎo)率最高的是5.85%(畢單18)，其次為4.94%(T 32×R 273)，最低的為0.17%(BND 001)。對不同雜優(yōu)類群雜交種質(zhì)誘導(dǎo)率分析發(fā)現(xiàn)，同一雜優(yōu)類群內(nèi)部雜交的雜交種質(zhì)誘導(dǎo)率高低順序依次是蘇灣×蘇灣、瑞德×瑞德、P群×P群、蘭卡斯特×蘭卡斯特、塘四平頭×塘四平頭、墨白×墨白、地方種。不同雜優(yōu)類群雜交種質(zhì)的誘導(dǎo)率高低順序依次是蘭卡斯特×P群、蘭卡斯特×瑞德、P群×瑞德。

表2 農(nóng)大高誘1號對不同雜交種質(zhì)的誘導(dǎo)率

2.3 農(nóng)大高誘1號對不同雜優(yōu)類群、不同世代單倍體誘導(dǎo)率的分析

將所有參試材料按照雜優(yōu)類群進(jìn)行劃分(表3)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，墨白、P群、蘇灣、蘭卡斯特和塘四平頭自交系種質(zhì)平均誘導(dǎo)率分別為1.50%、5.54%、1.56%、1.22%和0.95%，墨白、P群、蘇灣、蘭卡斯特和塘四平頭雜交種質(zhì)平均誘導(dǎo)率分別為1.62%、2.73%、4.94%、2.00%和1.66%。可見，自交系種質(zhì)中，P群的平均誘導(dǎo)率最高；雜交種質(zhì)中，蘇灣的平均誘導(dǎo)率最高。除P群自交系種質(zhì)誘導(dǎo)率高于雜交種質(zhì)外，其余種質(zhì)資源均為雜交種質(zhì)誘導(dǎo)率高于自交系種質(zhì)。

表3 農(nóng)大高誘1號對不同雜優(yōu)類群、世代單倍體誘導(dǎo)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 單倍體籽粒鑒定與植株鑒定

本研究基于R-nj遺傳標(biāo)記系統(tǒng)對玉米籽粒進(jìn)行單倍體鑒定，結(jié)果(表4)表明，二者結(jié)果差異較大，錯(cuò)誤率極高，錯(cuò)誤率最高的為Y 054，達(dá)到100%，最低的為Mo 17×B 73，達(dá)71.38%，可見利用肉眼對籽粒進(jìn)行單倍體鑒定結(jié)果較不準(zhǔn)確，需進(jìn)一步的田間植株鑒定。

表4 單倍體籽粒鑒定與植株鑒定

2.5 不同種質(zhì)自交系、雜交種單倍體誘導(dǎo)率的比較

不同種質(zhì)自交系誘導(dǎo)率比較發(fā)現(xiàn)(表5)，墨白、P群、地方種、旅大紅骨、蘇灣、蘭卡斯特和塘四平頭間差異均達(dá)顯著水平(p<0.01)；不同雜交種質(zhì)誘導(dǎo)率比較發(fā)現(xiàn)(表6)，墨白×墨白和塘四平頭×塘四平頭種質(zhì)誘導(dǎo)率未達(dá)顯著水平(p>0.05)，蘭卡斯特×瑞德、蘇灣×蘇灣、蘭卡斯特×P群、蘭卡斯特×蘭卡斯特、P群×P群、P群×瑞德、地方種和瑞德×瑞德間差異均達(dá)到顯著水平(p<0.01)。

表5 不同種質(zhì)自交系間的誘導(dǎo)率多重比較

表6 不同雜交種質(zhì)間的誘導(dǎo)率多重比較

3 討 論

本研究結(jié)果表明，農(nóng)大高誘1號對9個(gè)自交系的單倍體平均誘導(dǎo)率為1.86%，13個(gè)雜交種質(zhì)的單倍體平均誘導(dǎo)率為2.51%，農(nóng)大高誘1號對不同基因型(自交系和雜交)種質(zhì)的誘導(dǎo)效率存在差異。自交系的單倍體平均誘導(dǎo)率比中國農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的農(nóng)大高誘1號對不同基因型材料單倍體誘導(dǎo)率低(5.34%)[11]，也比農(nóng)大高誘1號不同種質(zhì)和世代單倍體誘導(dǎo)率低(3.9%)[14]，這可能與黔西北地區(qū)獨(dú)特的種質(zhì)資源基因型有關(guān)，還有待進(jìn)一步分析。本研究的雜交種質(zhì)的單倍體平均誘導(dǎo)率與馬駿等[15]的農(nóng)大高誘1號對玉米不同材料誘導(dǎo)結(jié)果(2.25%)相近，馬駿等選用的母本為引進(jìn)的抗大斑病材料與遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所選育的骨干自交系雜交的F1。

所有參試材料按照雜優(yōu)類群進(jìn)行劃分，墨白種質(zhì)、P群種質(zhì)、蘇灣種質(zhì)、蘭卡斯特種質(zhì)、塘四平頭種質(zhì)自交系的平均誘導(dǎo)率為1.50%、5.54%、1.56%、1.22%、0.95%；墨白雜交種質(zhì)、P群雜交種質(zhì)、蘇灣雜交種質(zhì)、蘭卡斯特雜交種質(zhì)、塘四平頭雜交種質(zhì)的平均誘導(dǎo)率為1.62%、2.73%、4.94%、2.00%、1.66%，除P群自交系種質(zhì)誘導(dǎo)率高于雜交種質(zhì)外，其余種質(zhì)資源均是雜交種質(zhì)誘導(dǎo)率高于自交系種質(zhì)。本研究中，農(nóng)大高誘1號對蘇灣雜交種質(zhì)的誘導(dǎo)率最高，墨白雜交種質(zhì)誘導(dǎo)率最低，且不同雜交種質(zhì)群之間的差異顯著。這和李國良等[14,16]的研究結(jié)果不同：農(nóng)大高誘1號對蘭卡斯特群誘導(dǎo)率最高，熱導(dǎo)地方種質(zhì)群誘導(dǎo)率最低，與4大種質(zhì)類群差異顯著。Chase SS[17]認(rèn)為，誘導(dǎo)效率與被誘導(dǎo)材料的基因型有很大關(guān)系，是由于母本基因型所產(chǎn)生的雌配子中有害基因的頻率不同造成的，經(jīng)過多代農(nóng)藝性狀改良的材料作母本比未經(jīng)改良材料產(chǎn)生單倍體頻率高。除P群自交系種質(zhì)外，本研究的其他結(jié)果和Chase SS的觀點(diǎn)一致。在育種實(shí)踐中，按照雜優(yōu)類群來選擇種質(zhì)非常重要。