嚴(yán)琳玲，張 瑜，王文強(qiáng)，郇恒福，虞道耿

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737)

銀合歡(LeucaenaBenth.)是豆科重要的熱帶牧草之一，多年生灌木或喬木，原產(chǎn)美洲，現(xiàn)廣泛分布于世界熱帶亞熱帶地區(qū)[1]。由于營(yíng)養(yǎng)豐富，干物質(zhì)中粗蛋白質(zhì)含量可達(dá) 21%～29%[2]，被譽(yù)為“奇跡樹(shù)”，“蛋白倉(cāng)庫(kù)”[3]，常被用作青飼、干飼、青貯和放牧家畜[4]。銀合歡具有生長(zhǎng)快、耐刈割、固氮等特點(diǎn)，可作為綠肥作物間作于幼齡膠園[5]。銀合歡葉還可用于蘑菇、香菇等食用菌的栽培基質(zhì)，并已有試驗(yàn)證明其可行性[6]。

鹽脅迫會(huì)造成種子發(fā)芽慢、種苗生長(zhǎng)畸形，從而導(dǎo)致減產(chǎn)，嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[7]，因此，在生產(chǎn)中，鹽漬土被認(rèn)為是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一種低產(chǎn)土壤類型[8]。我國(guó)鹽漬土約占耕地面積的 10%[9]。近年來(lái)，隨著工業(yè)發(fā)展、人口增長(zhǎng)和環(huán)境惡化等，土壤鹽堿化和次生鹽堿化面積不斷增加[10]。因此，改良和利用鹽漬土地已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一[11]。目前，篩選耐鹽新品種被廣泛認(rèn)為是改良利用鹽漬土的重要途徑之一[12]。

本研究在對(duì)銀合歡種質(zhì)資源進(jìn)行引進(jìn)調(diào)查的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步評(píng)價(jià)銀合歡種質(zhì)的育種價(jià)值，對(duì)18份種質(zhì)進(jìn)行芽期耐鹽評(píng)價(jià)，篩選芽期耐鹽銀合歡種質(zhì)，為研究銀合歡耐鹽機(jī)制及選育耐鹽品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料共18份，均從美國(guó)夏威夷大學(xué)引入并種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所牧草研究室基地。本試驗(yàn)所用種子為2012年采集。

1.2 試驗(yàn)方法

選擇籽粒飽滿、無(wú)病蟲(chóng)害且大小均一的健康種子30粒，用70%酒精消毒30～60 s，蒸餾水沖洗干凈置于培養(yǎng)皿中，以雙層濾紙為發(fā)芽床。用0.4%、0.8%、1.2% NaCl溶液10 mL模擬鹽脅迫處理，對(duì)照加入等量的蒸餾水，每處理重復(fù)3次，置于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照8 h，18 ℃，黑暗16 h。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

從種子置床之日起開(kāi)始觀察，以種子露白為發(fā)芽的開(kāi)始，參照《種子檢驗(yàn)學(xué)》進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的測(cè)定[8]，每天定時(shí)記錄每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)種子萌發(fā)數(shù)，萌發(fā)結(jié)束(萌發(fā)后期連續(xù)3 d無(wú)萌發(fā)種子)后，隨機(jī)抽取5株幼苗，測(cè)定根、芽的長(zhǎng)度以及幼苗的鮮重。胚芽、胚根長(zhǎng)度用游標(biāo)卡尺測(cè)量，幼苗鮮重用萬(wàn)分之一天平稱量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

為了減少各材料間固有的差異，采用性狀相對(duì)值進(jìn)行耐鹽性的綜合評(píng)價(jià)。數(shù)據(jù)使用相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)胚根長(zhǎng)、相對(duì)胚芽長(zhǎng)、相對(duì)胚根重、相對(duì)胚芽重。采用SPSS 18.0軟件對(duì)相對(duì)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析法進(jìn)行方差顯著性分析。

1.5 耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

計(jì)算各指標(biāo)的耐鹽指數(shù)[13]，并利用耐鹽指數(shù)進(jìn)行隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)其芽期耐鹽性。

耐鹽指數(shù)=3個(gè)鹽濃度下測(cè)定值的相對(duì)值

在進(jìn)行耐鹽隸屬函數(shù)值計(jì)算時(shí)，需利用以下公式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理：

(1)

式中，Xj表示第j個(gè)指標(biāo)值，Xmin表示第j個(gè)指標(biāo)的最小值，Xmax表示第j個(gè)指標(biāo)的最大值。

采用標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)法(S)，用公式(2)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)Vj，公式(3)歸一化后得到各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)Wj，公式(4)計(jì)算隸屬函數(shù)值D，隸屬函數(shù)值越大，表示銀合歡種質(zhì)在鹽脅迫下耐受力越強(qiáng)。

(2)

(3)

(4)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl脅迫對(duì)銀合歡種子相對(duì)發(fā)芽率的影響

在不同鹽濃度的處理下，隨著鹽濃度的升高，除L 01、L 05外，16份銀合歡種質(zhì)的相對(duì)發(fā)芽率均發(fā)生顯著性變化(p<0.05)，其中，L 02、L 03、L 06、L 07、L 08、L 09、L 10、L 11、L 12、L 13、L 15、L 16銀合歡種質(zhì)的相對(duì)發(fā)芽率隨著鹽濃度的升高而降低；L 04、L 18銀合歡種質(zhì)相對(duì)發(fā)芽率呈先降后增趨勢(shì)；L 14銀合歡種質(zhì)相對(duì)發(fā)芽率呈先增后降趨勢(shì)。在鹽濃度為0.4%時(shí)，有8份銀合歡種質(zhì)的相對(duì)發(fā)芽率高于100%，說(shuō)明其發(fā)芽率優(yōu)于對(duì)照，表現(xiàn)良好；當(dāng)鹽濃度為0.8%時(shí)，僅L 02、L 06的相對(duì)發(fā)芽率高于100%；當(dāng)鹽濃度為1.2%時(shí)，僅L 01、L 02的相對(duì)發(fā)芽率高于100%，說(shuō)明L 02表現(xiàn)出對(duì)鹽較強(qiáng)的適應(yīng)性。

對(duì)同一鹽濃度下的各銀合歡種質(zhì)的平均相對(duì)發(fā)芽率和變異系數(shù)進(jìn)行分析可知，隨著鹽濃度的增加，平均相對(duì)發(fā)芽率呈下降趨勢(shì)，變異系數(shù)呈增加趨勢(shì)，且當(dāng)鹽濃度達(dá)1.2%時(shí)，變異系數(shù)為21.3%，說(shuō)明高鹽濃度下銀合歡種質(zhì)間的相對(duì)發(fā)芽率差異較大，表現(xiàn)出對(duì)高鹽耐受力的不一致。

2.2 不同濃度NaCl脅迫對(duì)銀合歡種子相對(duì)發(fā)芽勢(shì)的影響

在不同濃度鹽脅迫下，L 02、L 04、L 06、L 07、L 08、L 09、L 10、L 11、L 13共9份銀合歡種質(zhì)均隨著鹽濃度的升高，相對(duì)發(fā)芽勢(shì)不同程度的降低，其中L 04、L 06、L 07、L 09、L 11、L 13相對(duì)發(fā)芽勢(shì)間的差異顯著(p<0.05)。同一濃度下銀合歡種質(zhì)的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)間差異達(dá)極顯著(p<0.01)，且從變異系數(shù)可看出，隨鹽濃度增加，變異系數(shù)呈增加趨勢(shì)，當(dāng)鹽濃度在0.4%及0.8%時(shí)，變異系數(shù)相差不大，分別為6.97%、18.74%，但當(dāng)鹽濃度為1.2%時(shí)，變異系數(shù)達(dá)48.46%，說(shuō)明在鹽濃度下各銀合歡種質(zhì)間的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)差異較大，表現(xiàn)出對(duì)高鹽適應(yīng)性的不一致。在18份種質(zhì)中，L 02在3個(gè)鹽濃度下相對(duì)發(fā)芽勢(shì)均高于100%；L 06、L 07、L 08在鹽濃度為0.4%和0.8%時(shí)，相對(duì)發(fā)芽勢(shì)高于100%；L 04、L 10在鹽濃度為0.4%時(shí)，相對(duì)發(fā)芽勢(shì)高于100%。

2.3 不同濃度NaCl脅迫對(duì)銀合歡種子相對(duì)胚根長(zhǎng)的影響

由表2可看出，L 03、L 05、L 07、L 09、L 11、L 14、L 17、L 18共8份銀合歡種質(zhì)隨鹽濃度上升，相對(duì)胚根長(zhǎng)逐漸下降。方差分析表明，不同的鹽濃度處理對(duì)18份銀合歡種質(zhì)間的相對(duì)胚根長(zhǎng)均有極顯著差異(p<0.01)。對(duì)同一濃度下各銀合歡種質(zhì)間相對(duì)胚根長(zhǎng)的變異系數(shù)可知，不同鹽濃度間相對(duì)胚根長(zhǎng)變異系數(shù)變化范圍不大，為16.61%～26.35%，當(dāng)鹽濃度為1.2%時(shí)，其變異系數(shù)最大(26.35%)，說(shuō)明低鹽較高鹽對(duì)種質(zhì)間相對(duì)胚根長(zhǎng)的影響小。18份銀合歡種質(zhì)中，在鹽濃度為0.4%時(shí)，除L 08、L 13、L 16、L 18外，其余14份銀合歡種質(zhì)的相對(duì)胚根長(zhǎng)大于100%，說(shuō)明低鹽濃度下，14份銀合歡種質(zhì)的胚根長(zhǎng)優(yōu)于對(duì)照，有利于胚根生長(zhǎng)；在鹽濃度為0.8%時(shí)，僅L 01、L 02、L 05、L 06、L 07、L 12、L 14、L 15、L 17共9份種質(zhì)相對(duì)胚根長(zhǎng)大于100%；當(dāng)鹽濃度為1.2%時(shí)，僅L 01、L 02、L 06、L 07、L 12、L 15、L 17共7份種質(zhì)相對(duì)胚根長(zhǎng)大于100%。

表2 不同濃度NaCl脅迫對(duì)銀合歡種子相對(duì)胚根長(zhǎng)和相對(duì)胚芽長(zhǎng)的影響

2.4 不同濃度NaCl脅迫對(duì)銀合歡種子相對(duì)胚芽長(zhǎng)的影響

除L 01、L 03、L 10、L 12、L 14、L 15、L 16外，其余11份銀合歡種質(zhì)相對(duì)胚芽長(zhǎng)在不同鹽濃度下差異顯著(p<0.05)，同一鹽濃度下各銀合歡種質(zhì)間的相對(duì)胚芽長(zhǎng)差異達(dá)極顯著(p<0.01)，并且變異系數(shù)隨著鹽濃度的增加而增加，但變化范圍不大，在14.37%～16.93%。除L 01、L 03、L 05、L 10、L 12、L 13、L 18外，其余11份銀合歡種質(zhì)的相對(duì)胚芽長(zhǎng)均隨著鹽濃度的增加而降低。

2.5 不同濃度NaCl脅迫對(duì)銀合歡種子相對(duì)幼苗苗重的影響

由表3可看出，L 01、L 02、L 03、L 04、L 12、L 14、L 15、L 16共8份銀合歡種質(zhì)隨鹽濃度上升，幼苗相對(duì)苗重逐漸下降。方差分析表明，不同的鹽濃度處理對(duì)18份銀合歡種質(zhì)間的相對(duì)苗重均有極顯著差異(p<0.01)。對(duì)同一濃度下各銀合歡種質(zhì)間相對(duì)胚根長(zhǎng)的變異系數(shù)可知，不同鹽濃度間相對(duì)胚根長(zhǎng)變異系數(shù)變化范圍不大，為15.40%～31.20%，當(dāng)鹽濃度為1.2%時(shí)，其變異系數(shù)最大(31.20%)，說(shuō)明低鹽較高鹽對(duì)種質(zhì)間相對(duì)苗重的影響小。18份銀合歡種質(zhì)中，在鹽濃度為0.4%和0.8%時(shí)，除L 09、L 12、L 13、L 14、L 15、L 16外，其余12份銀合歡種質(zhì)的相對(duì)苗重大于100%，說(shuō)明低中鹽濃度下，12份銀合歡種質(zhì)的相對(duì)苗重優(yōu)于對(duì)照，有利于植株生長(zhǎng)；當(dāng)鹽濃度為1.2%時(shí)，僅L 02～L 08、L 10、L 11、L 17、L 18共11份種質(zhì)相對(duì)苗重大于100%。

表3 不同濃度NaCl脅迫對(duì)銀合歡種子相對(duì)苗重的影響

2.6 銀合歡種質(zhì)耐鹽指標(biāo)的相關(guān)性分析

對(duì)鹽脅迫下銀合歡種質(zhì)的5個(gè)性狀的相對(duì)值進(jìn)行了相關(guān)性分析，其中，發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)間的相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)為0.918，發(fā)芽勢(shì)與幼苗鮮重、胚根長(zhǎng)與胚芽長(zhǎng)呈極顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.841和0.872；發(fā)芽率與鮮重、發(fā)芽率與胚芽長(zhǎng)之間的相關(guān)性也較高，相關(guān)系數(shù)為0.77和0.545。

2.7 銀合歡種質(zhì)的模糊隸屬函數(shù)耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)銀合歡種質(zhì)鹽脅迫的耐受性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。隸屬值越大，耐鹽性越強(qiáng)。由表5可看出，18份銀合歡種質(zhì)的綜合評(píng)價(jià)值介于0.12～0.92，其中綜合評(píng)價(jià)值大于0.8的種質(zhì)有2份，即L 02、L 07，表明其具有極強(qiáng)的耐鹽能力；其次為L(zhǎng) 06、L 17、L 01、L 04、L 03、L 05、L 08，綜合評(píng)價(jià)值大于0.5；綜合評(píng)價(jià)值小于0.3的材料有2份，即L 13、L 16，耐鹽能力較弱，7份材料的綜合評(píng)價(jià)值介于0.3～0.5之間，耐鹽性居中。

表4 NaCl脅迫下銀合歡種質(zhì)幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)

表5 鹽脅迫下銀合歡種質(zhì)各生長(zhǎng)指標(biāo)相對(duì)值的隸屬值

2.8 銀合歡種質(zhì)的耐鹽性聚類分析

基于歐氏距離、采用可變類平均法對(duì)16份銀合歡種質(zhì)的耐鹽性進(jìn)行聚類分析，由圖1可看出，在歐氏距離>5時(shí)，16份銀合歡被分為三類：第Ⅰ類包括L 05、L 08、L 03、L 04、L 01、L 11、L 18、L 10、L 14、L 06、L 17，這類種質(zhì)耐鹽性排序均位于中間，屬于中等耐鹽種質(zhì)；第Ⅱ類包括L 12、L 15、L 13、L 09、L 16，這類種質(zhì)耐鹽性排序前5位，可初步認(rèn)定此類種質(zhì)為鹽敏感種質(zhì)；第Ⅲ類包括L 02和L 07，此類種質(zhì)耐鹽排序在最前，可認(rèn)定為高耐鹽種質(zhì)。

圖1 銀合歡種質(zhì)萌芽期耐鹽性的聚類分析

3 討 論

耐鹽鑒定是牧草新品種選育的重要內(nèi)容之一，而植物在芽期及幼苗期對(duì)鹽分脅迫反應(yīng)較為敏感[14]。因此，植物鹽脅迫的試驗(yàn)階段主要集中在苗期及萌芽期，苗期試驗(yàn)主要為大田、盆栽及水培試驗(yàn)。大田試驗(yàn)雖然最接近于植物的自然生長(zhǎng)情況，但卻易受到天氣的影響，且評(píng)價(jià)時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力[15]；盆栽和水培法雖然不受天氣的影響，但需要在特定的環(huán)境下進(jìn)行，成本高[16,17]；而萌芽期進(jìn)行鹽脅迫試驗(yàn)既可以一次性評(píng)價(jià)大量種質(zhì)，又有較強(qiáng)的可操作性和可控性[18-21]，且發(fā)芽時(shí)間短、花費(fèi)小。研究表明，芽期是研究作物耐鹽強(qiáng)弱重要時(shí)期之一[22-23]，且其評(píng)價(jià)結(jié)果與苗期有一定的一致性[24]。因此，萌芽期的耐鹽性評(píng)價(jià)有利于加速耐鹽品種的選育[25]。

研究表明，萌芽期對(duì)鹽濃度的響應(yīng)最為敏感[26-31]，芽期對(duì)鹽濃度的耐受力會(huì)直接影響苗期的生長(zhǎng)發(fā)育，且其耐鹽性評(píng)價(jià)多從種子萌發(fā)指數(shù)(發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì))和生長(zhǎng)指數(shù)(胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)、苗重)進(jìn)行綜合分析，但由于品種的差異導(dǎo)致其對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)存在一定差異。有研究認(rèn)為，隨著鹽濃度的增加，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)均隨之降低，且差異顯著[29,30,32-34]，而胚芽和胚根長(zhǎng)、苗重則會(huì)出現(xiàn)降低[32]或先增后降[29,35]2種趨勢(shì)。本研究結(jié)果表明，隨鹽脅迫強(qiáng)度增加，部分銀合歡種質(zhì)在低鹽濃度下相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)呈上升趨勢(shì)，但在高鹽濃度下卻呈下降趨勢(shì)，這也說(shuō)明低鹽對(duì)部分銀合歡種子萌發(fā)具有一定促進(jìn)作用；但其胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)則表現(xiàn)出不規(guī)則的變化，部分銀合歡種質(zhì)在鹽脅迫下胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)顯著增加，部分銀合歡種質(zhì)則表現(xiàn)顯著降低。

牧草的抗逆性綜合評(píng)價(jià)方法很多[36]。由于植物對(duì)鹽脅迫的相應(yīng)是個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，為了避免片面性，在鹽脅迫評(píng)價(jià)時(shí)多采用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)[37]。本研究以相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)胚根長(zhǎng)、相對(duì)胚芽長(zhǎng)、相對(duì)苗鮮重為指標(biāo)，以不同鹽濃度各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值均值為依據(jù)，通過(guò)聚類分析將18份銀合歡種質(zhì)的耐鹽性劃分三類：耐鹽種質(zhì)L 02和L 07；中等耐鹽種質(zhì)L 05、L 08、L 03、L 04、L 01、L 11、L 18、L 10、L 14、L 06、L 17；鹽敏感種質(zhì)L 12、L 15、L 13、L 09、L 16。

通過(guò)對(duì)引進(jìn)的銀合歡種質(zhì)芽期耐鹽性的鑒定可以為選育耐鹽性強(qiáng)的銀合歡品種提供種質(zhì)材料，進(jìn)而滿足當(dāng)前對(duì)鹽堿地種植草種的需求。但本試驗(yàn)僅從芽期探討了銀合歡的抗旱性，還需要在幼苗期進(jìn)一步驗(yàn)證，以便更準(zhǔn)確地篩選出耐鹽銀合歡種質(zhì)。