吳潔瑩 孫遜沙 李發(fā)濤 陳勁松 謝閨娥 李 焱 吳韶清

1 廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心(廣州 510623) 2 中山大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心(廣州 510623) 3 中山大學附屬第一醫(yī)院(廣州 510080) 4 廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院(廣州 510182)

近年來，CRISPR/Cas9(the clustered regularly interspaced short palindromicrepeats /CRISPR-associated protein 9)基因編輯技術應用于生物醫(yī)學領域是研究熱點之一，具有重要的研究意義和實際應用價值[1-2]。相對于歸巢核酸內切酶、鋅指核酸酶和轉錄激活樣效應因子核酸酶技術，CRISPR/Cas9能夠精準、快速、有效地實現(xiàn)目標基因的編輯，而且實驗操作簡單及成本低廉[3]。本研究擬構建靶向CXCR7基因的CRISPR/Cas9質粒，轉染人胚腎細胞系HEK293T，編輯CXCR7基因，為進一步研究CXCR7基因在干細胞中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒及相關試劑

HEK293T細胞由中山大學中山醫(yī)學院楊中漢教授饋贈；CRISPR/Cas9 骨架質粒pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) 由北京微旋基因技術有限公司饋贈；大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5α購自天根生化(北京)科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；Lipofectemine 3000購自Invitrogen公司；菌液PCR試劑盒購自北京擎科生物科技有限公司；Bbs I酶、PNK酶和連接酶購自NewEngland Biolabs公司；無內毒素質粒提取試劑盒購自Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 設計靶向編輯CXCR7基因的sgRNA

利用http://cripr.mit.edu 網站設計單鏈導向RNA(single guide RNA，sgRNA)，選擇具有高度特異性且脫靶可能性低的sgRNA，本研究選擇其中兩對sgRNA進行實驗研究(見表1)，這兩對sgRNA 的靶向位點均位于CXCR7基因的第2號外顯子上。

1.2.2 構建sgRNA-CXCR7-PX458 質粒

將合成的sgRNA按照文獻方法進行末端磷酸化和退火[1]，并以1:200 的比例稀釋。BbsⅠ酶切PX458，純化后連接sgRNA。取連接體系2 μL轉化大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5α，接種于含50 mg/mL氨芐西林的平板上，12～16 h后，每個平板選擇3 個單菌落，分別含50 mg/mL氨芐西林的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～18 h。按照質粒提取試劑盒說明書進行質粒抽提，用PCR擴增抽提質粒，上游引物用U6-F，下游引物用各sgRNA的bottom序列(見表1)，然后用上游引物進行Sanger測序鑒定。正確的質粒分別標記為sgRNA1-CXCR7-PX458質粒和sgRNA2-CXCR7-PX458質粒。

表1 sgRNA和引物序列

續(xù)表

1.2.3 質粒轉染HEK 293T細胞系

按照2×105個/孔的密度接種HEK 293T 細胞到24 孔細胞培養(yǎng)板中，24 h后，按照Lipofectamine 3000試劑盒說明書操作指南，每孔轉染sgRNA1-CXCR7-PX458質?；騭gRNA2-CXCR7-PX458質粒500 ng，72 h后采用流式細胞儀(BD FACS Aria Sorp)分選出表達GFP陽性的HEK 293T細胞，擴增培養(yǎng)后，小部分細胞用于提取基因組DNA，大部分細胞液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩Ｌ崛NA經PCR擴增后進行Sanger 測序。

2 結果

2.1 成功構建2個sgRNA-CXCR7-PX458質粒

sgRNA-CXCR7和PX458 載體質粒骨架連接后，sgRNA-CXCR7-PX458質粒轉化大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5α，經鋪板和菌落培養(yǎng)，提取的質粒DNA經PCR擴增(見圖1)和Sanger 測序鑒定，2個sgRNA 分別插入PX458 質粒相應位置，測序結果見圖2，顯示sgRNA 插入了正確的位置。

圖1 sgRNA-CXCR7-PX458擴增電泳圖

圖2 sgRNA-CXCR7-PX458質粒測序結果

2.2 兩個sgRNA-CXCR7-PX458質粒分別成功轉染至HEK 293T細胞

將sgRNA1-CXCR7-PX458質粒和sgRNA2-CXCR7-PX458質粒分別轉染HEK 293T細胞，72 小時后，采用流式細胞儀分選GFP陽性細胞，以未轉染的HEK 293T細胞為陰性對照，設定GFP的陰性邊界，結果顯示，sgRNA1-CXCR7-PX458質粒轉染的HEK 293T 細胞中有23.42%表達GFP，sgRNA2-CXCR7-PX458質粒轉染的HEK 293T細胞中有22.30%表達GFP。見圖3。

圖3 轉染HEK 293T細胞系72h采用流式細胞術分選GFP陽性細胞

2.3 HEK 293T 細胞中的CXCR7基因被有效編輯

經Sanger 測序鑒定，sgRNA1-CXCR7-PX458質粒轉染過的HEK293T細胞在第112與113位編碼氨基酸之間產生了插入和/或缺失(NP_064707.1)，sgRNA2-CXCR7-PX458質粒轉染過的HEK 293T細胞在第87與88位編碼氨基酸之間產生了插入和(或)缺失，均為PAM之前3個堿基左右的位置，即Cas9切割雙鏈DNA的位置，產生了重疊峰的圖像，表明此處發(fā)生插入和/或缺失，因而，CXCR7基因被有效編輯。見圖4。

圖4 HEK293T細胞CXCR7基因被編輯后的測序圖

3 討論

CRISPR 系統(tǒng)由CRISPR基因簇和Cas蛋白組成，在細菌和古細菌中參與獲得性免疫防御，降解噬菌體等外源的遺傳物質。具體的機制為：當噬菌體首次進入宿主細胞后，CRISPR系統(tǒng)識別其核酸及外源DNA的PAM序列(protospacer sdjacent motif)，選取一段DNA序列加工重組到CRISPR簇的5′端，形成新的非重復間隔序列，從而將外來的基因片段整合進細菌細胞的基因組。當具有相同核酸序列的噬菌體再次入侵時，CRISPR系統(tǒng)轉錄出前體crRNA，加工成熟后與相關的Cas蛋白結合形成crRNA-Cas9蛋白復合體，然后通過堿基互補配對結合外源DNA并切割，使得形成DNA雙鏈缺口(double stranded breaks，DSB)，從而激活細胞的修復機制。細胞通過兩種機制進行修復，一種是非同源末端連接修復機制，此時可能產生幾個堿基的插入或者缺失，導致相應基因發(fā)生移碼突變或者無義突變，從而實現(xiàn)基因的敲除；另一種是通過同源重組機制修復，可以將外源性基因準確插入基因組[4-5]。CRISPR/Cas 9基因編輯技術自2013年首次應用以來，迅速被廣泛應用于生物醫(yī)學領域，并獲得不少進展和成果[1,6]。

采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯干細胞內的相關基因，進行干/祖細胞分化、疾病模型建立、藥物篩選和再生醫(yī)學等方面的研究[7-8]。Negoro R等[9]建立了多重耐藥基因(Multiple drug resistance 1，MDR1)敲除的人誘導多能干細胞(human induced pluripotent stemcells，iPSCs)，能夠用于藥物代謝動力學研究。Wang H等[10]用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除人胚胎干細胞的肌段同源盒2基因(muscle segment homeobox2，MSX2)，誘導該細胞分化成造血干細胞，證明該基因是胚胎干細胞分化成造血干細胞的調控基因。Golchin A等[11]認為間充質干細胞作為一種安全有效的細胞治療資源，同CRISPR/Cas9系統(tǒng)的聯(lián)合應用，將會極大地提高其臨床利用價值和效果。Kim YK等[12]用正常人來源的誘導多能干細胞，建立了α-半乳糖苷酶缺失的細胞系，為法布瑞氏癥的基礎研究提供可靠的手段，為該罕見病的治療開發(fā)新方案提供了奠定了基礎。

趨化因子受體7(C-X-C chemokine receptor 7, CXCR7)是G蛋白偶聯(lián)的七次跨膜蛋白受體(seven-transmembrane receptors，7-TMRs)，其基因定位于人類染色體2q37，作為CXCL12的第二受體，親和性比CXCR4高10倍。CXCR7基因最初是從狗的甲狀腺cDNA序列中分離出來的。目前已知，正常情況下，CXCR7在人的心臟、腦、脾、腎、肺、睪丸、卵巢、甲狀腺和胎盤等組織中是高表達的，肝以及胸腺中表達量較低。在造血系統(tǒng)，CXCR7主要表達于外周血的單核細胞、粒細胞和血小板以及骨髓中的淋巴細胞和粒細胞上[13-14]。而在疾病相關研究中發(fā)現(xiàn)，在炎癥、感染、缺血和腫瘤形成中，CXCR7的表達是上調的。另外，人類微血管內皮細胞在缺氧和酸性環(huán)境下，其CXCR7表達也是上調的。CXCR7廣泛參與多種生物學功能，包括炎性應答、免疫應答、免疫監(jiān)控和組織修復再生。CXCR7具有促進血管新生能力，包括胚胎發(fā)育中的血管發(fā)生，以及腫瘤生長和轉移過程中的新生血管形成。已有報道表明，CXCR7在調控細胞遷移、黏附、增殖、存活和分化等方面具有重要作用[15-16]。

近年來，干細胞技術發(fā)展迅速，干細胞的基礎研究和干細胞的臨床應用已經成為了目前生物醫(yī)學領域最活躍的研究熱點之一。由于CXCR7在細胞研究領域的重要作用，使得CXCR7在胚胎干細胞、神經干細胞、造血干細胞、間充質干細胞和誘導多能干細胞中的功能研究不斷被報道。如Kowalski K等[17]報道，CXCR7對調節(jié)胚胎發(fā)育過程中的關鍵發(fā)育調節(jié)子表達是必需的，而且CXCR7參與了胚胎干細胞多能性的控制和向中胚層譜系的分化。Shao Y等[18]發(fā)現(xiàn)，過表達CXCR7的間充質干細胞明顯促使間充質干細胞歸巢至受損的肺組織，同時促進間充質干細胞向Ⅱ型肺泡上皮細胞的分化，并增強了間充質干細胞調節(jié)炎癥反應的能力。Chen Q等[19]報道，CXCR7在神經祖細胞遷移中起重要作用，在CXCR4缺失的情況下，CXCR7激活細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)1/2，并充當CXCL12介導的神經祖細胞遷移的功能受體。

綜上所述，建立靶向CXCR7的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，對研究CXCR7的功能具有重要意義，本研究建立了該編輯系統(tǒng)，并在人胚腎細胞系HEK293T 中成功進行了CXCR7基因的編輯，為進一步的干細胞中的CXCR7基因編輯和功能研究奠定基礎。