薛林科 戴興德 張小林

(甘肅醫(yī)學(xué)院公共課教學(xué)部, 平?jīng)?744000)

油脂作為三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，向人體提供能源和必需脂肪酸[1,2]，碘值是評(píng)價(jià)油脂不飽和程度的重要參數(shù)[3]，碘值越高則說(shuō)明油脂不飽和程度愈大，對(duì)人體健康越有利，因此碘值的測(cè)定在油脂日常檢測(cè)中具有十分重要的意義[4,5]。油脂碘值的測(cè)定方法主要分為化學(xué)法和紅外光譜法[6,7]?；瘜W(xué)法中韋氏法作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)最為常用[8,9]，準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，但測(cè)定過(guò)程較為復(fù)雜。將返熒光技術(shù)應(yīng)用于油脂碘值分析，國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)報(bào)道。

羅丹明B(Rhodamine B, RB)具有熒光特性，I3-離子可通過(guò)靜電引力與RB的陽(yáng)離子形成離子締合物，并使其熒光猝滅[10-13]。韋氏液主要成分為ICl，具有強(qiáng)氧化性，加入過(guò)量碘化鉀生成可溶性碘(I3-)，碘溶液(I3-)和RB混合的瞬間即可發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，若在韋氏液中提前加入不飽和油脂，ICl因與不飽和鍵發(fā)生加成，締合物“RB-I3-”中的I3-減少，溶液重新發(fā)出熒光，其熒光強(qiáng)度變化值與油脂碘值在一定范圍內(nèi)有相關(guān)性，據(jù)此實(shí)現(xiàn)返熒光猝滅法測(cè)定油脂碘值，其過(guò)程不受樣品渾濁度和色度影響且有極低的檢出限。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

930N熒光分光光度計(jì)，pHS-3C精密pH計(jì)。

一氯化碘、RB、醋酸、醋酸鈉、冰醋酸、碘化鉀：均為分析純；水為二次蒸餾水。

1.2 溶液配制

韋氏標(biāo)準(zhǔn)液(ICl)：5.00×10-4mol/L。1.6 g氯化碘溶于100 mL環(huán)己烷和冰乙酸的等體積混合溶劑中，用硫代硫酸鈉標(biāo)定其濃度，將標(biāo)定液二次稀釋為5.00×10-4mol/L，低溫避光保存。

RB標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.119 8 g RB固體，加水溶解并稀釋定容至250 mL，配成濃度為1.00×10-3mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為儲(chǔ)備液，使用時(shí)稀釋至1.00×10-4mol/L。

10%碘化鉀溶液；0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.5)。

1.3 方法原理與量值追溯

過(guò)量韋氏液(ICl) 與油脂中的不飽和雙鍵進(jìn)行定量的加成反應(yīng)：

剩余ICl與碘化鉀生成可溶性碘(I3-)：

ICl+KI=I2+KCl

I2+I-= I3-

在弱酸環(huán)境下，I3-與RB陽(yáng)離子通過(guò)靜電引力形成締合物，締合反應(yīng)導(dǎo)致羅丹明B熒光猝滅，油脂加入前后猝滅程度有差異。

量值追溯是基于原始記錄而實(shí)現(xiàn)，包括樣品來(lái)源、溶劑類(lèi)型、取樣量、試劑用量、儀器參數(shù)、熒光測(cè)定等方面，熒光強(qiáng)度F是原始記錄，油脂加入前后熒光強(qiáng)度變化值ΔF體現(xiàn)其不飽和度(碘值)，通過(guò)與國(guó)標(biāo)(韋氏法)作比較，可實(shí)現(xiàn)返熒光猝滅法的量值追溯。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣液制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取油脂樣品5 g于100 mL容量瓶中，加入50 mL混合溶劑 (環(huán)己烷和冰乙酸等體積混合) 振蕩溶解，最后用混合溶劑定容，將該溶液再次稀釋100倍作為樣品處理液。

1.4.2 樣品測(cè)定

準(zhǔn)確移取10 μL樣液于50 mL容量瓶中，加韋氏液0.20 mL，塞緊瓶塞，搖勻后室溫靜置60 min，加10%碘化鉀液1 mL，RB溶液 5.00 mL，醋酸-醋酸鈉緩沖溶液5 mL，蒸餾水定容，靜置5 min后，以365 nm作激發(fā)波長(zhǎng)，580 nm作發(fā)射波長(zhǎng)，1.00×10-6mol/L RB作靈敏度調(diào)試液，測(cè)定熒光強(qiáng)度F。同時(shí)完成樣品空白實(shí)驗(yàn)F0測(cè)定，按公式計(jì)算食用油碘值(g/100 g)。

ΔF=F-F0

式中：M為樣品質(zhì)量/g；126.9為I+摩爾質(zhì)量/g/mol；k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(k=100.1)。

1.4.3 過(guò)程比較

國(guó)標(biāo)方法(韋氏法)與返熒光猝滅法過(guò)程比較見(jiàn)表1。

表1 兩種方法測(cè)定過(guò)程比較

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

RB、ICl+KI+RB、油脂+ICl+KI+RB三種體系的熒光光譜見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，當(dāng)λex=365 nm時(shí)，RB在580 nm處有一最大熒光峰(曲線a)，加入韋氏液和碘化鉀反應(yīng)液后，熒光猝滅，但峰位未發(fā)生改變(曲線b)，說(shuō)明RB和碘(I3-)發(fā)生了締合；在RB-I3-締合物形成之前按照“油脂+ ICl+I-+RB”順序加入油脂，熒光得以恢復(fù)(曲線c)，即熒光強(qiáng)度與油脂不飽和度有關(guān)聯(lián)。

注：a為RB體系；b為ICl+KI+RB體系；c為油脂+ICl+KI+RB體系。圖1 不同體系的熒光光譜

2.2 RB用量的確定

在醋酸-醋酸鈉緩沖介質(zhì)中，完成不同體積RB稀釋液的熒光熒光強(qiáng)度測(cè)定。其結(jié)果說(shuō)明RB在0～5 mL范圍內(nèi)稀釋液熒光強(qiáng)度與體積有線性關(guān)系，當(dāng)V(RB)>5 mL時(shí)，熒光強(qiáng)度趨于恒定，該結(jié)果與文獻(xiàn)[18]報(bào)道相一致，即當(dāng)c(RB)≥1.0×10-2mmol/L時(shí)，RB會(huì)形成二聚體或多聚體，自熄滅作用增強(qiáng)，線性度消失。故RB溶液用量確定為5.00 mL。

2.3 締合物pH環(huán)境考察

由于pH對(duì)RB[10]和碘(I3-)的存在形式有明顯影響，進(jìn)而影響RB與I3-之間的締合作用，在最佳試劑用量條件下，改變“ICl+KI+RB”體系pH值進(jìn)行試驗(yàn)。圖2表明，隨著pH值的增加，RB熒光強(qiáng)度逐漸增大；pH 4.0～8.0時(shí)，熒光強(qiáng)度趨于恒定；pH值大于9.0時(shí)，締合物中的I3-發(fā)生歧化(I3-+2OH-=IO-+ 2I-+H2O)，體系熒光強(qiáng)度出現(xiàn)二次增大。pH介于4.0～8.0時(shí)，更有利于RB和I3-締合，本方法選擇pH=4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液作熒光探針緩沖介質(zhì)。

2.4 反應(yīng)時(shí)間和溫度的確定

取10 μL樣品處理液，在最佳試劑用量條件下，分別改變“油脂+ICl+KI+RB”體系加成反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，油脂不飽和鍵與I+反應(yīng)速度較慢，在0～50 min內(nèi)體系熒光強(qiáng)度呈恢復(fù)態(tài)勢(shì)(圖3)，50 min后熒光強(qiáng)度達(dá)到最大并趨于恒定，故韋氏液加入后靜置時(shí)間確定為60 min。升高溫度，“油脂+ICl+KI+RB”體系熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，締合作用減弱；當(dāng)溫度超過(guò)60 ℃時(shí)，體系熒光強(qiáng)度與單純RB體系趨于一致，猝滅現(xiàn)象消失，因此，測(cè)定在室溫下進(jìn)行。

圖2 pH條件影響

圖3 動(dòng)力學(xué)曲線

圖4 韋氏液用量影響及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

針對(duì)“ICl+KI+RB”體系，在已確定的實(shí)驗(yàn)條件下，僅改變韋氏(ICl)標(biāo)準(zhǔn)溶液用量(0～0.5 mL)，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定熒光強(qiáng)度。圖4表明，隨著韋氏液量的增加，RB的熒光強(qiáng)度逐漸降低，當(dāng)韋氏液加入量增加到0.25 mL時(shí)，RB的熒光強(qiáng)度開(kāi)始呈現(xiàn)平緩趨勢(shì)，0.40 mL時(shí)RB的熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。在0～0.2 mL范圍內(nèi)二者有較好線性度，即碘(I+)濃度在0～2 μmol/L范圍內(nèi)與體系熒光強(qiáng)度(F)有良好的線性關(guān)系(圖4內(nèi)插圖)，線性方程為F=230.8-100.1c(μmol/L)，相關(guān)系數(shù)r=0.984 5，韋氏碘(I+)檢出限為3.2×10-9mol/L，該曲線作為食用油碘值測(cè)定模型方程。

2.6 樣品分析與模型檢驗(yàn)

取一定量樣品, 按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定碘值。另取一定量樣品用碘量法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品分析(n=6)

兩種方法具有較好的精密度，熒光法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD控制在0.33%～1.56%范圍內(nèi)，滿(mǎn)足儀器分析要求，熒光法測(cè)定結(jié)果與碘量法相比較，相對(duì)誤差RE≤1.86%。按文獻(xiàn)[15]所給方法對(duì)表1中棕櫚油的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)表明，熒光法和國(guó)標(biāo)法之間無(wú)顯著性差異，由此可見(jiàn)，該模型用于測(cè)定食用植物油碘值是可行的。

3 結(jié)論

本研究基于“碘-羅丹明B”締合物熒光探針實(shí)現(xiàn)返熒光猝滅法測(cè)定食用油脂碘值，方法簡(jiǎn)單且具有很好的靈敏度；在580 nm發(fā)射波長(zhǎng)處，RB取5.00 mL，pH 4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液作緩沖介質(zhì)，反應(yīng)50 min后，加成碘檢測(cè)限達(dá)到3.2×10-9mol/L；統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，熒光法可代替碘量法(國(guó)標(biāo)法)用于油脂碘值測(cè)定。