于麗欣 鄭樹東 孫 超 柏云會(huì) 楊加虎 陳晶亮 汪 騫 楊進(jìn)成 林良斌

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院1，昆明 650201) (玉龍縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心2，麗江 674100) (云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所3 ，昆明 650201) (玉溪市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院4，玉溪 653100)

菜籽油是一種營(yíng)養(yǎng)保健的食用油，富含人體必需不飽和脂肪酸，特別是油酸達(dá)60%以上，越來越受到人們的青睞。但我國(guó)食用油仍有很大的缺口，而油菜(BrassicanapusL)是我國(guó)主要油料作物，發(fā)展油菜生產(chǎn)是保障我國(guó)食用油安全的有效途徑。提高菜籽含油量是當(dāng)前油菜育種和栽培的主要目標(biāo)之一。油菜種子中的油脂累積是一個(gè)十分復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及到光合作用、糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解、脂肪酸合成、油脂合成、油體形成等。例如光系統(tǒng)II BY蛋白(photosystem II BY，PSBY)和光系統(tǒng)II反應(yīng)中心PSB28蛋白(photosystem II reaction center PSB28 protein，PSB28)參與了光合作用，對(duì)光系統(tǒng)II中間體的RC47分別起組裝保護(hù)和激活作用[1，2]；蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(sucrose transporters 1，SUC1)和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白12(sugertransportprotein 12，STP12)參與了糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程，將光合產(chǎn)物從“源”器官運(yùn)輸至種子等“庫(kù)”器官中[3-4]；丙酮酸脫氫酶E1α(pyruvate dehydrogenase E1 α，PDH-E1α)和烯醇化酶1(enolase 1，ENO1)參與了糖酵解過程，PDH-E1α是丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(pyruvate dehydrogenase complex, PDHC)的重要部分，PDHC進(jìn)一步將丙酮酸脫氫脫羧，產(chǎn)生脂肪酸合成的原料乙酰輔酶A[5]，而ENO1為質(zhì)體內(nèi)的合成代謝過程提供烯醇式丙酮酸PEP，經(jīng)由丙酮酸激酶(pyruvate kinase)的催化，進(jìn)而生成ATP以及丙酮酸[6]；以上這些與含油量的關(guān)系研究均鮮見報(bào)道。乙酰輔酶A羧化酶1(acetyl CoAcarboxylase 1，ACC1)參與了脂肪酸合成，它將乙酰輔酶A羧化丙二酸單酰輔酶A，是一個(gè)脂肪酸合成過程第一個(gè)限速酶，在油菜中過表達(dá)擬南芥ACC1基因，使T2代種子含油量增加約5%[7]。提高或抑制參與這些過程的酶或蛋白編碼基因的表達(dá)水平，將會(huì)影響油菜種子的含油量，這已被許多基因工程研究的結(jié)果所證實(shí)[8-16]。一些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控這些過程中相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控植物種子的含油量[17-21]。一些基因表達(dá)和酶活性的研究結(jié)果也說明了這一點(diǎn)，如：甘油-3-磷酸脫氫酶基因BnGPDHc2-1、BnGPDHc2-2在高含油自交系30DAF的種子中的表達(dá)量顯著高于低油含量自交系的[22]；BnACC1基因在油菜種子成熟期的相對(duì)表達(dá)量與油脂積累呈現(xiàn)顯著正相關(guān)[23]；但BnDGAT1、BnPDAT1的qPCR分析說明其表達(dá)量與菜籽含油量并不呈現(xiàn)出一致的正相關(guān)，這可能與其取材的環(huán)境因素不一致有關(guān)；在30DAF后的油菜種子中G6PDH、ATP-檸檬酸裂解酶、ACCase、PPase、DGAT的酶活性與菜籽含油量呈顯著或極顯著正相關(guān)[24-27]。對(duì)油脂累積通路上的基因表達(dá)、酶活性與菜籽含油量相關(guān)性的研究?jī)H涉及到幾個(gè)基因和酶。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)油脂累積通路上有幾百個(gè)基因參與，可能不同基因型材料的種子含油量分別是不同的基因在起關(guān)鍵作用。為此，我們選取轉(zhuǎn)錄組分析差異表達(dá)顯著(未發(fā)表)的PSB28、PSBY、SUC1、STP12、PDH-E1α、ENO1、ACC1等7個(gè)基因進(jìn)行qPCR及其蛋白或酶活性分析，探究它們?cè)诓煌土坑筒似贩N的角果皮或種子中的表達(dá)水平與菜籽含油量的關(guān)系，為揭示油菜含油量的分子機(jī)制及油菜高含油量育種與栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為3個(gè)不同含油量的甘藍(lán)型油菜品種：ZY511，湘油15號(hào)，湘774，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究室提供。其中ZY511為浙江農(nóng)科院選育的常規(guī)油菜品種，其原種含油量為50.21%；湘油15號(hào)和湘774為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的常規(guī)油菜品種，其原種含油量分別為42%和37.32%。

1.2 方法

1.2.1 油菜種植與取樣

2018年10月，將3種油菜材料種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山農(nóng)場(chǎng)同一塊實(shí)驗(yàn)地，統(tǒng)一進(jìn)行油菜常規(guī)栽培管理。油菜開花時(shí)，對(duì)健康、長(zhǎng)勢(shì)一致的油菜植株的主花序上花蕾掛牌并標(biāo)注日期。一定時(shí)間后同時(shí)從3個(gè)油菜品種上分別取開花后第23、33、43 d的角果，立即帶回實(shí)驗(yàn)室。在冰浴條件下將種子和角果皮分離，隨即分裝，每管0.2 g，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 含油量與主要脂肪酸含量的測(cè)定

待成熟時(shí)收獲同一株的菜籽，曬干后除去雜質(zhì)，將干凈的油菜種子送至河南大學(xué)，用NIR 5000型近紅外光譜分析儀測(cè)定種子的含油量和主要脂肪酸的含量。

1.2.3 RNA樣品提取與檢測(cè)

RNA提取過程參照RNA提取試劑盒說明書，取1 μL RNA樣品于紫外分光光度計(jì)(Nano Drop ND-2000)檢測(cè)RNA的純度和濃度，記錄A260/280和A260/A230的吸光值；1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的測(cè)定

將轉(zhuǎn)錄組分析獲得的基因序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)分析，用primer 5.0軟件根據(jù)基因特異序列設(shè)計(jì)引物，以便排除同源基因的干擾。以100 ng總RNA為模板，按照BestarqPCR RT Kit說明書配制20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，合成cDNA第一鏈，并保存?zhèn)溆谩eal time PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μL(DBI Bestar?SybrGreenqPCRmasterMix)，程序?yàn)?4 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算公式為2-ΔΔct。

1.2.5 粗蛋白液的制備

從-80 ℃冰箱中取出材料放入預(yù)冷的研缽中，加液氮后迅速研磨成粉末，將粉末盡量全部轉(zhuǎn)移入10 mL離心管內(nèi)；加2 mL 4 ℃預(yù)冷的提取緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl pH=7.3、5 mmol/L DTT、2 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L PMSF、300 mmol/L甘油、0.01%體積Triton X-100)，振動(dòng)2 min充分混勻，4 ℃靜置1 h；再加10 μL 0.5 mmol/L PMSF并混勻，4 ℃靜置1 h；4 ℃、4 000 r/min離心30 min，將上清液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，用去離子水定容至2 mL，取200 μL粗蛋白液分裝至PCR管中，-80 ℃保存待用。

1.2.6 ELISA測(cè)定蛋白或酶活性

將粗蛋白液按公司試劑盒說明書并使用多功能酶標(biāo)儀(VarioskanLUX)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及酶活性和蛋白含量測(cè)定，重復(fù)3次。每克鮮組織的酶活力及蛋白含量(U/g或ng/g)的計(jì)算公式為b/a×2 000÷0.2，其中a為樣品孔添加的粗蛋白液量，b為根據(jù)樣品孔所測(cè)得OD450值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得的粗蛋白液樣品的酶活力單位或蛋白量。

表1 不同油菜品種的種子含油量與脂肪酸含量/%

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及作圖；采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同油菜品種的種子含油量及其脂肪酸含量分析

對(duì)不同油菜品種的種子含油量及其脂肪酸含量進(jìn)行近紅外光譜分析儀檢測(cè)，結(jié)果(表1)表明供試油菜品種的種子含油量差異顯著，最高的是ZY511(43.38%)，其次為湘油15號(hào)(37.23%)，湘774含油量最低(34.75%)，但其含油量均低于原種4～7個(gè)百分點(diǎn)，這可能與油菜成熟期氣溫過高有關(guān)。供試油菜品種的油酸、亞油酸、飽和脂肪酸的含量在品種間差異顯著，但芥酸、亞麻酸的含量在品種間差異不顯著。并且油酸含量高的品種亞油酸含量低，油酸含量低的品種亞油酸含量高，這可能與油酸是亞油酸的底物有關(guān)。

2.2 種子中油脂累積相關(guān)基因的差異表達(dá)

為了探究STP12、PDH-E1α、ENO1、ACC1的表達(dá)與油菜含油量的關(guān)系，檢測(cè)了不同發(fā)育時(shí)期油菜種子中其RNA和蛋白水平。結(jié)果(圖1)表明隨著種子發(fā)育的進(jìn)程4個(gè)基因表達(dá)水平均呈上升趨勢(shì)，而且43DAF時(shí)其RNA和蛋白質(zhì)水平與含油量呈現(xiàn)出一致的關(guān)系，即含油量高的材料中其表達(dá)水平也高，含油量低的其表達(dá)水平也低，表現(xiàn)為ZY511>湘油15號(hào)>湘774，而33DAF或之前的基因表達(dá)水平并不與含油量呈完全一致的關(guān)系，這表明30DAF～40DAF雖然是菜籽油脂累積的快速時(shí)期，但并不是菜籽含油量高低的決定時(shí)期，而種子發(fā)育的后期才可能是菜籽油脂積累的重要時(shí)期，基因表達(dá)水平?jīng)Q定著菜籽含油量的高低。但不同基因的表達(dá)模式存在一定的差異，STP12、PDH-E1α、ACC1的RNA水平隨著種子發(fā)育的進(jìn)程顯著性增加，但增幅不到3倍，而ENO1的RNA水平在33DAF前的ZY511種子中增加不顯著，但到43DAF時(shí)急速增加，3個(gè)品種均增幅10倍以上。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)23DAF、33DAF基因表達(dá)的RNA水平與蛋白水平在品種間呈現(xiàn)出不一致的現(xiàn)象，但43DAF則表現(xiàn)出一致性。如STP12的RNA水平在23DAF時(shí)湘油15號(hào)與ZY511差異不顯著，但其蛋白水平ZY511顯著低于湘油15號(hào)；33DAF時(shí)RNA水平差異顯著，即ZY511高于湘油15號(hào)，但其蛋白水平差異不顯著。PDH-E1α、ACC1的RNA水平在23DAF時(shí)3個(gè)品種間差異不顯著，但其蛋白水平差異顯著；33DAF時(shí)PDH-E1α的RNA水平在湘774與湘油15號(hào)間差異不顯著，但蛋白水平湘油15號(hào)顯著高于湘774；33DAF時(shí)ACC1的RNA水平ZY511顯著高于湘油15號(hào)，但其蛋白水平則反之，即湘油15號(hào)顯著高于ZY511。ENO1的RNA水平在33DAF時(shí)ZY511顯著低于湘油15號(hào)，但其蛋白水平ZY511顯著高于湘油15號(hào)。引起這種RNA水平與蛋白水平不一致現(xiàn)象的可能有兩個(gè)原因：一是不同品種的基因中簡(jiǎn)并密碼子使用不同，同一氨基酸在一個(gè)品種的基因中使用偏愛密碼子，而在另一個(gè)品種的基因中使用限制密碼子，這樣即使RNA水平相同，但其翻譯速度不一樣，因此，蛋白水平不同；二是由于qPCR的引物是根據(jù)基因特異序列設(shè)計(jì)的，確保定量檢測(cè)的特異性。而蛋白檢測(cè)所用的抗體是植物類或擬南芥蛋白的抗體，酶聯(lián)免疫反應(yīng)的特異性就會(huì)大大降低，ELISA檢測(cè)的是一類蛋白，而不是某個(gè)基因編碼的特異蛋白，如果在油菜種子發(fā)育早期有多個(gè)同源基因低水平表達(dá)，而在菜籽含油量決定期只是油脂累積的同源基因表達(dá)，就會(huì)導(dǎo)致早期(種子發(fā)育)檢測(cè)的RNA水平與蛋白水平不一致，而晚期(油脂累積)檢測(cè)的一致。

注：圖1中的abc均表示為各組多重比較的顯著水平為P<0.05。下同。圖1 油菜種子中油脂累積相關(guān)基因表達(dá)

2.3 角果皮中油脂累積相關(guān)基因差異表達(dá)

為探究油菜角果皮的光合作用與菜籽含油量的關(guān)系，本研究選取在不同含油量油菜品種角果皮中差異表達(dá)顯著的PSBY、PSB28和SUC1等基因進(jìn)行RNA和蛋白水平定量檢測(cè)。結(jié)果(見圖2)表明隨著種子發(fā)育的進(jìn)程3個(gè)基因表達(dá)水平均呈上升趨勢(shì)，而且43DAF時(shí)的RNA和蛋白水平與菜籽含油量均呈一致的關(guān)系，即含油量高的材料中其基因表達(dá)水平也高，含油量低的材料中其基因表達(dá)水平也低，表現(xiàn)為ZY511>湘油15號(hào)>湘774，但23DAF、33DAF時(shí)的RNA和蛋白水平與菜籽含油量呈現(xiàn)出不一致的關(guān)系，這些暗示了43DAF時(shí)光合產(chǎn)物和糖轉(zhuǎn)運(yùn)是專為油脂合成的，而之前特別是23DAF的光合產(chǎn)物和糖轉(zhuǎn)運(yùn)主要用于角果和種子的生長(zhǎng)。3個(gè)基因的表達(dá)模式存在一定的差異，RNA水平都隨著種子發(fā)育的進(jìn)程顯著性增加，但蛋白水平PSBY在湘774中呈下降再上升的趨勢(shì)，其他2個(gè)基因與RNA變化趨勢(shì)一致。此外，PSBY和PSB28的RNA水平增加緩慢，43DAF時(shí)最大的增幅也不超過6倍，而SUC1則快速增加，43DAF時(shí)3個(gè)品種均增幅10倍以上。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)角果皮中基因表達(dá)的RNA水平與蛋白水平也與種子中基因表達(dá)一樣，均呈現(xiàn)出品種間不一致的現(xiàn)象。

圖2 油菜角果皮中油脂累積相關(guān)基因表達(dá)

3 討論

培育高含油量油菜品種是油菜育種的重要目標(biāo)之一，也是油菜產(chǎn)業(yè)增收的重要方式。油脂累積通路上的基因表達(dá)水平影響著菜籽的含油量。本研究發(fā)現(xiàn)油脂累積通路上的基因表達(dá)隨著種子發(fā)育的進(jìn)程均呈上升趨勢(shì)，這可能是因?yàn)镈NA的甲基化水平隨著發(fā)育時(shí)期的進(jìn)程其DNA去甲基化逐漸增強(qiáng)，從而導(dǎo)致基因表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)。但33DAF或之前的基因表達(dá)水平與含油量并不呈完全一致的關(guān)系，而43DAF時(shí)基因表達(dá)水平與油菜種子含油量均呈現(xiàn)一致的關(guān)系，說明后期的基因表達(dá)水平與菜籽含油量密切相關(guān)，是決定油菜含油量的關(guān)鍵時(shí)期。這與劉祥含等[27]的研究結(jié)果一致，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、乙酰輔酶A羧化酶、磷脂酸磷酸酯酶、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶在油菜種子發(fā)育過程中隨著種子發(fā)育進(jìn)程其酶活性均呈逐漸上升趨勢(shì)，38DAF時(shí)達(dá)到峰值，維持一定時(shí)間后再逐漸下降。陳玉萍等[24,28]研究表明油菜種子的含油量隨種子發(fā)育的進(jìn)程呈上升趨勢(shì)，從25DAF到30DAF油分積累較慢，30DAF后油分積累較快，種子的含油量迅速上升，40DAF后油分積累減慢，含油量上升較慢。這說明了30DAF～40DAF是油脂快速累積時(shí)期，似乎與菜籽的含油量密切相關(guān)。本研究結(jié)果與其并不一致，可能是雖然30DAF～40DAF是菜籽油脂快速累積期，但并不是含油量的決定期。因此，這一時(shí)期的基因表達(dá)水平并不與含油量呈一致的關(guān)系。40DAF后才是油菜含油量的決定期，油脂累積通路上基因表達(dá)水平的高低決定了菜籽含油量的高低。本研究的qPCR檢測(cè)結(jié)果表明隨種子發(fā)育進(jìn)程基因表達(dá)的RNA水平是逐漸上升的，這與虢慧等[29]研究結(jié)果不一致，她們發(fā)現(xiàn)在不同含油量油菜品種的種子發(fā)育過程中BnACC1、BnPDAT1、BnPDAT1的表達(dá)呈波浪式變化趨勢(shì)，這可能與取材時(shí)的環(huán)境條件不同有關(guān)。在本研究中還發(fā)現(xiàn)33DAF或之前的基因表達(dá)的RNA水平與蛋白水平不一致，這可能與蛋白檢測(cè)的ELISA法所選用的抗體特異性有關(guān)。由于本研究的ELISA試劑盒的抗體為植物或擬南芥某一蛋白的抗體，而不是油菜某一基因編碼蛋白的抗體，這樣抗原-抗體反應(yīng)特異性就會(huì)降低，檢測(cè)到的可能是基因家族的同源基因的編碼蛋白，而不是某一基因編碼的特異蛋白，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的RNA水平與蛋白水平不一致。因此，在今后研究中，如要采用ELISA法檢測(cè)某一特異蛋白，應(yīng)要通過基因工程的方法制備出這一基因的特異蛋白，然后去免疫動(dòng)物獲得特異抗體。此外，甘藍(lán)型油菜是異源4倍體，幾乎在其基因組中每一功能基因都存在多個(gè)拷貝。因此，qPCR的引物設(shè)計(jì)需要格外注意其特異性，否則就會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。

4 結(jié)論

本研究利用qPCR和ELISA技術(shù)，以3個(gè)不同含油量的甘藍(lán)型油菜品種為材料，研究發(fā)現(xiàn)油脂累積通路上ACC1、ENO1、PDH-E1α、STP12、SUC1、PSB28、PSBY基因在種子和角果皮中的RNA和蛋白水平的表達(dá)量隨著種子發(fā)育的進(jìn)程均呈上升趨勢(shì)，但在不同含油量品種中33DAF或之前的基因表達(dá)水平與菜籽含油量呈不完全一致的關(guān)系，而43DAF時(shí)基因表達(dá)水平與菜籽含油量均呈一致的關(guān)系，由此推斷種子發(fā)育后期的基因表達(dá)水平與菜籽含油量密切相關(guān)，是決定油菜含油量的關(guān)鍵時(shí)期。