童曄玲 胡軼娟 # 樓柯浪 陳思思 朱佳依

1 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

2 浙江省中藥新藥研發(fā)重點實驗室 浙江 杭州 310007

貓爪草為毛茛科小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根，具有化痰散結(jié)、解毒消腫之功效，用于瘰疬痰核、疔瘡腫毒、蛇蟲咬傷等[1]。在我國廣泛分布于廣西、臺灣、江蘇、浙江、江西、湖南、安徽、湖北、河南等省[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，貓爪草具有調(diào)節(jié)免疫功能[3]、抗腫瘤[4]、抑菌[5]等作用。貓爪草含有黃酮類及其苷類[6]、內(nèi)酯類、脂肪酸及其酯和甾醇類等[7]。其中穗花杉雙黃酮（Amentoflavone）是貓爪草黃酮類成分中的一個重要成分，分子式為C30H18O10，藥理學(xué)研究證明其具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤[8]和促骨生成的作用。本文建立了貓爪草中穗花杉雙黃酮的含量測定方法，為貓爪草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供一定的參考。

1 材料

1.1 實驗藥品：貓爪草，購自浙江省立同德醫(yī)院中藥房，經(jīng)鑒定為毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根。穗花杉雙黃酮（A0536）：成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 儀器：BP211D電子分析天平（萬分之一、十萬分之一）：Sartorius；Aligent1260液相色譜儀：四元泵、自動進(jìn)樣器、DAD檢測器、柱溫箱；YMC-Pack ODS-A色譜柱（5μm，250×4.6mm）；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：色譜柱：YMC-Pack ODS-A（5μm，250×4.6mm）HPLC色譜柱；流動相：甲醇-0.05%磷酸溶液；流速：1.0ml/min；檢測波長：269nm，柱溫：25℃。在此條件下，樣品中穗花杉雙黃酮與相鄰成分達(dá)到基線分離，見圖1。

圖1 對照品和供試品溶液的高效液相色譜圖

2.2 供試品溶液的制備：取本品粉末約0.5g，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30min，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得。進(jìn)樣前用0.45μm微孔濾膜濾過。

2.3 對照品溶液的制備：精密稱取穗花杉雙黃酮對照品適量，置容量瓶中，加甲醇制成每毫升含0.1mg的溶液，搖勻，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別精密吸取對照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10μl，注入液相色譜儀，測定，記錄峰面積，以峰面積A為縱坐標(biāo)，穗花杉雙黃酮的濃度C（μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明穗花杉雙黃酮在1.16～11.6μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（回歸方程為：A=10.012C-1.103，r=0.9997）。

2.5 檢測限：取穗花杉雙黃酮對照品溶液，按比例稀釋，測定檢測限為1.16ng。

2.6 精密度試驗：取本品粉末0.5g，共6份，精密稱定，按“2.2供試品溶液的制備”操作，精密吸取10μl，測定，結(jié)果貓爪草中穗花杉雙黃酮的平均含量為0.0812mg/g，RSD為4.21%。

2.7 加樣回收試驗：稱取已知含量的同一批樣品6份，精密稱定，置25ml量瓶中，分別精密加入不同量的對照品溶液，按“2.2供試品溶液的制備”操作，測定，計算，平均回收率為98.15%，RSD為3.58%，結(jié)果見表2。

表2 樣品回收率試驗結(jié)果

2.8 樣品測定：分別取5個不同批號樣品，按“2.2供試品溶液的制備”操作，并進(jìn)行測定計算，結(jié)果見表3。

表3 貓爪草藥材中穗花杉雙黃酮的含量（n=3）

3 討論

3.1 供試品溶液的制備：超聲提取和加熱回流提取為中藥材有效成分含量測定中運用最多的兩種提取方式，本文對超聲提取和加熱回流提取兩種方式進(jìn)行了比較，結(jié)果表明兩種提取方式的提取效率相近，由于超聲提取的操作更簡單方便，本研究選擇超聲提取進(jìn)行供試品溶液的制備。提取溶劑對提取效率的影響非常大，本研究對甲醇、乙醇、80%甲醇、80%乙醇、60%甲醇和60%乙醇對穗花杉雙黃酮的提取效率進(jìn)行了比較，結(jié)果表明甲醇對貓爪草中穗花杉雙黃酮的提取效率最高，因此本研究選擇甲醇作為提取溶劑。另外，本研究還對不同超聲提取時間進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，超聲提取30分鐘后，隨著提取時間的延長，并不能提高提取效率，故認(rèn)為超聲提取30分鐘已能將穗花杉雙黃酮提取完全，因此確定提取時間為30分鐘。

3.2 色譜條件：本研究對各種色譜柱對穗花杉雙黃酮的分離進(jìn)行了比較，采用依利特Hypersil DBS C18（5μm，4.6mm×250mm）、COSMOSIL（5μm，4.6mm×250mm）、Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4.6mm×250mm）、YMC-pack ODS-A（5μm，4.6mm×250mm）、Thermo Hypersil GOLD（5μm，4.6mm× 250mm）、SUPELCO C18（5μm，4.6mm×250mm）等6種色譜柱進(jìn)行實驗，結(jié)果表明，穗花杉雙黃酮在這六種色譜柱上都能得到較好的分離。本研究還對流動相系統(tǒng)進(jìn)行了考察，比較了甲醇-磷酸系統(tǒng)和乙腈-磷酸系統(tǒng)，結(jié)果表明這兩種流動相系統(tǒng)都能對穗花杉雙黃酮進(jìn)行較好的分離。

3.3 與現(xiàn)有的貓爪草質(zhì)量控制方法比較：貓爪草為《中國藥典》2015年版一部收錄的品種，對其質(zhì)量控制主要是通過性狀鑒別、顯微鑒別和薄層鑒別進(jìn)行，缺乏定量控制方法。有學(xué)者對貓爪草中成分的定量分析進(jìn)行了研究，吳曉等對貓爪草中的總糖、多糖含量進(jìn)行了測定[9]，池玉梅等以蘆丁為對照品對貓爪草藥材中總黃酮的含量進(jìn)行了測定[10]，還有學(xué)者對貓爪草的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析[11]。但上述研究均未對代表貓爪草生理活性的單一成分進(jìn)行研究。本文對貓爪草中穗花杉雙黃酮的含量進(jìn)行測定，并建立了含量測定方法，可以為貓爪草的質(zhì)量控制指標(biāo)的確定提供一定的參考。