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        烏藥葉中總黃酮的含量測定及提取工藝優(yōu)選

        2020-10-22 03:10:20毛培江王志安
        浙江中醫(yī)雜志 2020年10期
        關(guān)鍵詞:黃酮工藝實驗

        孫 嫣 業(yè) 康 毛培江 王志安#

        1 杭州市第一人民醫(yī)院 浙江 杭州 310006

        2 浙江省中藥研究所有限公司 浙江 杭州 310023

        烏藥,為樟科植物烏藥Lindera aggregata(Sims)Kosterm的干燥塊根,有行氣止痛、溫腎散寒的功效。烏藥作為浙江的道地藥材,使用至今已經(jīng)有一千多年的歷史,其具有良好的醫(yī)用價值。本實驗采用紫外分光光度法測定烏藥葉提取物中總黃酮含量,并對影響提取總黃酮的因素進行了考察,通過正交試驗優(yōu)選出最佳提取工藝,為中藥新藥的研發(fā)提供技術(shù)支持。

        1 試劑與儀器

        1.1 實驗藥品與試劑:烏藥葉干品由浙江紅石梁集團天臺山烏藥有限公司供給,于當年春季的浙江天臺地區(qū),經(jīng)蒸(殺青)、揉捻、干燥(溫度55~60℃,時間6~7h)等工序加工制得,由浙江中藥研究所有限公司中藥資源室鑒定為樟科胡椒屬植物烏藥[Lindera aggregata(Sims)Kosterm.]的葉片(批號為20180501);蘆丁對照品,由中國食品藥品檢定研究院提供(批號為100080-201610),純度為92.6%;95%乙醇為食品級;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、甲醇均為分析純;實驗用水為純化水,提取用水為飲用水。

        1.2 實驗儀器:上海亞榮RE-5210A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;Shimadzu UV-2550型紫外可見分光光度計;上海精宏DKS24型電熱恒溫水浴鍋;昆山KQ-100DB型超聲波提取儀。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 烏藥葉提取工藝的優(yōu)選:分述如下。

        2.1.1 烏藥葉提取溶劑的選擇:前處理:烏藥葉粉碎,過20目篩。水提物:烏藥葉粗粉200g加入6倍量的水煎煮提取2次,每次1小時,提取液減壓濃縮(60℃,-0.07~-0.1Mpa)至1g生藥/ml。醇提物:烏藥葉粗粉200g加入6倍量70%乙醇回流提取2次,每次0.5小時,提取液減壓濃縮(60℃,-0.07~-0.1Mpa)至1g生藥/ml。烏藥葉水提和醇提兩種方式的固形物提取率分別為12.49%和10.67%,總黃酮提取率分別為2.21%和3.46%,說明兩種方法都可以提取總黃酮。

        2.1.2 烏藥葉醇提工藝參數(shù)優(yōu)選:為了確定烏藥葉的最佳提取條件,按總黃酮提取率(%)為主要指標,以單因素實驗考察提取溶劑乙醇的濃度,實驗設(shè)置50%、70%、90%3個水平,烏藥葉粗粉200g分別加各個濃度的乙醇6倍量提取2次,每次0.5小時,提取液減壓濃縮(60℃,-0.07~-0.1Mpa)至1g生藥/ml。結(jié)果顯示,烏藥葉在70%乙醇提取固形物提取率較低,總黃酮提取率為3.46%,提取率最高。

        選用L9(34)表對烏藥葉提取次數(shù)(A)(1次、2次、3次)、提取時間(B)(0.5h、1h、1.5h)、溶劑用量(C)(4倍、6倍、8倍)3個因素進行醇提正交實驗,根據(jù)各個因素均確定為3個水準。在70%乙醇提取的烏藥葉中正交實驗記錄見表1、表2,方差法結(jié)果表明:FA>F0.05(2,2),因素A的水平變化對本次實驗結(jié)果有顯著性影響,本實驗提取工藝的最佳方案為:烏藥葉加6倍量70%乙醇提取2次,第1次1小時,第2次0.5小時,可獲得較好的提取效果。

        表1 烏藥葉總黃酮乙醇提取正交實驗

        表2 方差分析表

        2.1.3 烏藥葉水提工藝參數(shù)優(yōu)選:選用L9(34)表對提取次數(shù)(A)(1次、2次、3次)、提取時間(B)(0.5h、1h、1.5h)、溶劑用量(C)(6倍、8倍、10倍)3個因素進行水提正交實驗,根據(jù)每個因素均確定為3個水平,按優(yōu)化的醇提工藝提取后的烏藥葉藥渣再用水作為溶劑進行提取,藥材量按最初投料量計。正交實驗記錄見表3、表4,方差法結(jié)果表明:FA>F0.05(2,2),因素A的水平變化對實驗結(jié)果存在顯著性影響,提取工藝的最佳方案為:烏藥葉加8倍量水提取2次,第1次1小時,第2次0.5小時,可獲得較好的提取效果。

        表3 烏藥葉總黃酮水提取正交實驗

        表4 方差分析表

        2.2 烏藥葉中總黃酮的含量測定:分述如下。

        2.2.1 蘆丁標準溶液配制:精確稱取蘆丁標準品,用無水甲醇溶解并定容,配制成每毫升含蘆丁0.2mg的蘆丁標準溶液。

        2.2.2 試樣處理:精密量取提取液適量,水定容至25ml。取樣0.5ml,置10ml容量瓶中,甲醇加至3.5ml,再加0.5ml亞硝酸鈉溶液(5%),混勻,室溫放置6min,再加0.5ml硝酸鋁溶液(10%),混勻,放置6min,再加5ml氫氧化鈉溶液(1%),混勻,用水定容至刻度,放置12min后,以空白溶液為參比,在波長510nm處測吸光度,按標準曲線計算供試品溶液中蘆丁的重量(mg)即得。

        2.2.3 蘆丁標準曲線制備:準確吸取蘆丁標準溶液0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml,分別置于 10ml容量瓶中,加甲醇至3.5ml,按2.2.2方法顯色,以空白溶液為參比,在波長510nm處測定吸光度。以吸光度作為縱坐標,質(zhì)量作為橫坐標,繪制蘆丁標準曲線。

        2.2.4 烏藥葉中總黃酮測定方法學考察:①線性:在0.208~0.728mg質(zhì)量范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系,線性方程為y=1.022x+0.001,線性相關(guān)系數(shù)R=0.9994。②精密度:取蘆丁對照品2.5ml,按法測定吸光度,平行測定5次,計算吸光度RSD=0.21%,該方法精密度較好。③穩(wěn)定性:取同一批號烏藥葉提取物樣品1份,按方法處理后間隔一定時間測定吸光度,結(jié)果RSD為0.34%,顯示4小時內(nèi)樣品穩(wěn)定。④重復(fù)性:取同一批號的烏藥葉提取物樣品6份,檢測總黃酮含量。結(jié)果表明平均值為46.89mg/ml,RSD為0.155%,該方法重復(fù)性較好。⑤回收率:取重復(fù)性樣品,平行6份,分別加入適量對照品,按方法檢測總黃酮含量,計算回收率。結(jié)果表明回收率在95%~102%范圍,RSD<3%,該方法準確度較好。

        表5 回收率實驗

        3 分析與討論

        采用醇提和水提對烏藥葉進行提取研究,發(fā)現(xiàn)兩者均能提取出一定比例的總黃酮,推測黃酮類成分可能以苷類和游離狀態(tài)同時存在于烏藥葉中,經(jīng)單因素考察確定提取用乙醇濃度為70%,經(jīng)正交實驗確定本實驗選用先醇提后水提的方法,可以獲得更高的總黃酮提取率。亞硝酸鈉-硝酸鋁法為中華人民共和國藥典常用的檢測總黃酮含量的方法,通過考察該方法檢測烏藥葉總黃酮的線性、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性和回收率,證明此方法簡單可靠,適合烏藥葉及其提取物的總黃酮含量檢測。

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