（浙江優(yōu)科檢測技術(shù)有限公司，浙江 杭州 311100）

硝基呋喃類藥物主要包括呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃妥因和呋喃它酮，是一類人工合成的具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗生素。因其對(duì)大多數(shù)革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和原蟲等病原體均有較強(qiáng)的抑制和滅殺作用[1]，被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。有研究發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類化合物是直接致變劑，呋喃唑酮及其代謝物具有較強(qiáng)致突變、致畸和致癌作用[2]，已被大多數(shù)國家禁止用于動(dòng)物性食品[3]。我國農(nóng)業(yè)部于2002 年發(fā)布的第193號(hào)、第235號(hào)公告和2005年發(fā)布的第560號(hào)公告，將硝基呋喃類藥物列為禁用獸藥，嚴(yán)禁用于所有食品動(dòng)物[4]。但硝基呋喃藥物療效好、價(jià)格低廉，為提高水產(chǎn)品的成活率，提高經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，一些養(yǎng)殖戶在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中非法使用硝基呋喃類藥物的現(xiàn)象仍然存在。

硝基呋喃類抗生素不穩(wěn)定、代謝快，在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期短，但其代謝物常與組織中的蛋白質(zhì)以結(jié)合態(tài)的形式存在，可長期、穩(wěn)定地殘留于動(dòng)物體內(nèi)[5]，因此，目前通常以測定其代謝物的方式來監(jiān)控硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)的殘留量。

目前，硝基呋喃代謝物殘留的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法（ELISA）[6]、高效液相色譜（HPLC）[7]、高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）[8]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）[2-4]。其中，ELISA采用了特異性抗體，具有靈敏度高、經(jīng)濟(jì)、操作簡便、檢測時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，一般適用于篩選檢測，假陽性率較高。HPLC和HPLC-MS廣泛用于多組分混合物的分離和分析，但動(dòng)物組織基質(zhì)比較復(fù)雜，干擾較多，其準(zhǔn)確性和靈敏度難以達(dá)到痕量分析的要求。HPLC-MS/MS采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）模式，結(jié)合液相保留時(shí)間及MRM特征離子對(duì)進(jìn)行定性和定量，可減少于保留時(shí)間相同而待測離子不同所帶來的干擾，同時(shí)提高了檢測靈敏度，尤其適合于基質(zhì)復(fù)雜樣品的分析，已成為食品中硝基呋喃代謝物殘留檢測的主流分析方法[9]。

魚肉樣品通常含蛋白質(zhì)和脂肪，基質(zhì)復(fù)雜，通常需要凈化等前處理[10]，目前對(duì)動(dòng)物性食品中硝基呋喃代謝物殘留檢測的凈化方法主要有正己烷去脂肪[4]及固相萃取法[8]，這兩種方法操作都比較繁瑣，不適于快速檢測。QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）方法操作簡便，回收率好，操作效率高，最早應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測，在魚肉中也有關(guān)于氯霉素[11]、磺胺[12]和孔雀石綠[13]的檢測研究報(bào)道，但在硝基呋喃代謝物檢測中的應(yīng)用較少。本試驗(yàn)在農(nóng)業(yè)部783 號(hào)公告-1-2006的基礎(chǔ)上[14]，用QuEChERS凈化樣品，進(jìn)一步減少樣品基質(zhì)干擾，采用HPLC-MS/MS檢測硝基呋喃類藥物代謝物，為淡水魚中硝基呋喃代謝物殘留量的快速檢測提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

QSightTMAltus LC 30-QsightTM3Q Mass Spectrometer（高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Perkin Elmer公司）； 3K15臺(tái)式高速離心機(jī)（德國Sigma）；N-EVAP 12管氮?dú)鉂饪s儀（上海安譜）；Vortex Genius 3渦旋振蕩器（德國IKA）。

1.2 試劑

乙酸乙酯，甲酸（色譜純，美國Fisher Chemical）；Bond Elut QuEChERS萃取鹽包（內(nèi)含4 g MgSO4，1 g NaCl，1 g 檸檬酸鈉，0.5 g三水合二檸檬酸二鈉，上海安譜）；15 ml Bond Elut QuEChERS凈化管[內(nèi)含50 mgN-丙基乙二胺固相吸附劑（PSA）和150 mg C18，900 mg Na2SO4，美國Agilent公司]；Al2O3填料，100～300目（上海安譜）；2-硝基苯甲醛（百靈威）；HCl，NaCl，Na2SO4（分析純，廣州化學(xué)試劑有限公司）；5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ），氨基脲（SEM），1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD），3-氨基-2-惡唑烷基酮（AOZ，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）。

2 方法

2.1 樣品處理

稱取魚肉樣品4.00 g于50 ml離心管，加0.2 mol/L鹽酸溶液8.00 ml，0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液0.15 ml，渦旋混合1 min，37 ℃水浴恒溫震蕩衍生16 h。衍生后的樣品加入0.3 mol/L Na2SO41 ml，用2 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0～7.5，加入10 ml乙酸乙酯，渦旋混勻后加入萃取鹽包，渦旋提取1 min，8000 r/min、4 ℃離心5 min，取6 ml上清，移入QuEChERS凈化管，渦旋1 min后，8000 r/min、4 ℃離心5 min。取5 ml上清，40 ℃下氮吹至干，用20 %甲醇水1.00 ml溶解，過0.22 μm濾膜后供HPLC-MS/MS測定。

同時(shí)除不加樣品外，按上述步驟處理，做方法空白試驗(yàn)；另稱取樣品后添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述步驟處理樣品，做質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)。

2.2 儀器條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×150 mm，8 μm），柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μl，流動(dòng)相為2 mmol/L乙酸銨溶液和甲醇，流速0.3 ml/min，梯度洗脫程序見表1。正離子模式，離子化噴霧電壓4500 V，離子源溫度400 ℃，質(zhì)譜接口加熱氣溫度300 ℃，霧化器溫度150 ℃，反吹干燥氣100 ml/min，MRM參數(shù)見表2。

表1 HPLC梯度洗脫程序

表2 硝基呋喃代謝物衍生物質(zhì)譜分析參數(shù)

2.3 結(jié)果計(jì)算

樣品中硝基呋喃代謝物含量按公式X=（Ci×V）/m計(jì)算。其中X為樣品中硝基呋喃代謝物的含量（μg/kg）；Ci為樣品溶液中硝基呋喃代謝物的濃度（ng/ml）；m為樣品質(zhì)量（g）。

3 結(jié)果與分析

3.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

魚肉中含豐富的脂肪酸和蛋白質(zhì)，乙酸乙酯提取目標(biāo)衍生物的同時(shí)，也會(huì)提取出這些非極性干擾物，影響定性和定量分析結(jié)果，增加儀器的維護(hù)成本。QuEChERS作為一種快速的前處理技術(shù)，最早應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測，一般分為萃取和凈化兩部分。萃取鹽包中的檸檬酸鈉和三水合二檸檬酸二鈉可保持提取溶液的pH穩(wěn)定；NaCl能促進(jìn)目標(biāo)物從水相到有機(jī)相的轉(zhuǎn)移；MgSO4能大量吸收樣品中的水分，減少水相，促進(jìn)目標(biāo)物在有機(jī)相中的轉(zhuǎn)移，且MgSO4的水合作用會(huì)放出大量熱量，更有利目標(biāo)物從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相。C18和PSA是常用的吸附材料，其中C18除脂肪能力較強(qiáng)，PSA可同時(shí)減少脂類、糖類和其他有機(jī)酸的干擾，但魚肉中基質(zhì)復(fù)雜，分析脂肪含量較高的樣品時(shí)，C18和PSA的組合不能完全去除脂質(zhì)影響，因此本試驗(yàn)在美國Agilent公司提供的QuEChERS前處理方案基礎(chǔ)上，添加脂肪吸附能力更強(qiáng)的Al2O350 mg，達(dá)到更好的凈化效果。經(jīng)過改進(jìn)的QuEChERS前處理后，4種硝基呋喃代謝物衍生物的色譜分離結(jié)果見圖1。由圖1可見，4種硝基呋喃代謝物分離效果良好，峰形尖銳，無雜質(zhì)干擾，獲得良好的色譜分離效果。

圖1 4種硝基呋喃代謝物衍生物的色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限、定量限

分別移取硝基呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng/ml） 0.02，0.04，0.10，0.20，0.40 ml于50 ml離心管，除不加樣品外，按2.1項(xiàng)步驟前處理樣品，配制成1，2，5，10，20 μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各組分的濃度和峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比（S/N）為檢出限，以10倍S/N為定量限。各組分線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表3。

表3 4種硝基呋喃代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)

由表3可見，各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均在0.998以上，檢出限在0.07～0.16 μg/kg范圍內(nèi)，優(yōu)于農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006標(biāo)準(zhǔn)要求，定量限均小于0.5 μg/kg，優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)要求。

3.3 方法回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取4.00 g樣品于50 ml離心管，分別添加硝基呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 ng/ml）0.01，0.04，0.2 ml，4種代謝物的添加水平分別為0.25，1.00，5.00 μg/kg，按1.2步驟處理和凈化樣品，HPLC-MS/MS測定，做樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)。每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行試驗(yàn)，考察方法的回收率和精密度。4種目標(biāo)物的平均回收率為84 %～108 %，RSD為5.4 %～9.7 %，在農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006要求范圍內(nèi)。3個(gè)濃度水平的回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 4種硝基呋喃代謝物的回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3.4 實(shí)際樣品分析

采用本文建立的QuEChERS-HPLCMS/MS處理并檢測50批淡水魚樣品，結(jié)果僅有2份樣品中檢出AOZ陽性，其濃度分別為1.37和2.41 μg/kg，其他代謝物組分均未檢出。

4 小結(jié)

本文采用改進(jìn)的QuEChERS結(jié)合HPLC-MS/MS建立淡水魚中硝基呋喃代謝物殘留量的檢測方法，平均回收率為84 %～108 %，RSD為5.4 %～9.7 %，檢出限均小于0.2 μg/kg，定量限均小于0.5 μg/kg，各方法學(xué)性能指標(biāo)均優(yōu)于農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006。該方法快速，簡便，重復(fù)性好，靈敏度高，適用于淡水魚樣品中硝基呋喃代謝物的檢測分析，并為其他水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物的檢測提供參考。