（河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450008）

增強(qiáng)免疫力類保健食品可補(bǔ)充機(jī)體所需營(yíng)養(yǎng)成分，調(diào)節(jié)機(jī)體功能，提高免疫力。一些不法分子為求高額利潤(rùn)，向產(chǎn)品中添加針對(duì)性的化學(xué)藥品，從而提高產(chǎn)品療效，消費(fèi)者食用后，會(huì)因攝入化學(xué)藥物過(guò)量引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，對(duì)消費(fèi)者的身體造成嚴(yán)重傷害[1-3]。為進(jìn)一步規(guī)范食品市場(chǎng)，2019年12月1日《中華人民共和國(guó)食品安全法實(shí)施條例》等政策正式實(shí)施，這也表明保健食品市場(chǎng)監(jiān)管將更加嚴(yán)格。

目前，針對(duì)保健食品中非法添加物質(zhì)的檢測(cè)方法，最常用的是超高效液相色譜法（UPLC）[4]及液質(zhì)聯(lián)用方法（HPLC-MS），HPLC-MS一般采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式[5-10]，這些方法存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果等不足。本研究選取了增強(qiáng)免疫力類保健食品中常見添加的13個(gè)化學(xué)成分[11-12]，建立高效液相色譜-離子肼質(zhì)譜（HPLCITMS）分析方法，利用ITMS的優(yōu)點(diǎn)，選用MRM掃描觸發(fā)增強(qiáng)子離子掃描（MRM-IDA-EPI），首先可采用MRM掃描進(jìn)行定量分析和第一步定性分析，當(dāng)MRM檢測(cè)出超出預(yù)設(shè)值的信號(hào)時(shí)會(huì)觸發(fā)增強(qiáng)子離子掃描（EPI），獲得高質(zhì)量子離子譜圖，通過(guò)與譜庫(kù)中對(duì)應(yīng)化合物子離子譜圖對(duì)比，達(dá)到進(jìn)一步定性分析效果，完全避免假陽(yáng)性結(jié)果。方法學(xué)驗(yàn)證及樣品檢驗(yàn)證明建立的方法可用于增強(qiáng)免疫力類保健食品中非法添加的藥物成分的快速篩查及定量分析。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-30A超高效液相色譜儀（日本島津）；QTRAP 6500+三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX）；Milli-Q超純水器（美國(guó)密理搏公司）；KQ-600DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；XPE205型電子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 對(duì)照品與試劑

那紅地那非（批號(hào)：520039-201401，含量98.3 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；紅地那非（批號(hào)：520047-201401，含量99.9 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；伐地那非鹽酸鹽（批號(hào)：26480，含量99.3 %，北京曼哈格）；枸櫞酸羥基豪莫西地那非（批號(hào)：510032-201301，含量98.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；西地那非（批號(hào)：25530，含量99.9 %，北京曼哈格）；豪莫西地那非（批號(hào)：520046-201401，含量99.6 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；氨基他達(dá)拉非（批號(hào)：520042-201401，含量99.8 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；他達(dá)拉非（批號(hào)：25739，含量99.5 %，北京曼哈格）；硫代艾地那非（批號(hào)：26000，含量99.5 %，北京曼哈格）；偽伐地那非（批號(hào)：520041-201401，含量99.0 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；那莫西地那非（批號(hào)：520040-201401，含量99.5 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；去甲基他達(dá)拉非（批號(hào)：AL170606-14，含量98.56 %，Stanford Chemicals）；硫代西地那非（批號(hào)：26034，含量99.8 %，北京曼哈格）；甲醇，乙腈（色譜級(jí)，Merck）；甲酸（色譜級(jí)，Acros）；水為經(jīng)Milli-Q超純水器處理后的超純水。魚油軟膠囊（1000 mg/粒，批號(hào)：817250601，威海南波灣生物技術(shù)有限公司），澳天力牌蜂膠軟膠囊（500 mg/粒，批號(hào)：20180301-01，廣東美麗康保健品有限公司），大保龍牌螺旋藻咀嚼片（250 mg/片，批號(hào)：20180404，南寧富萊欣生物科技有限公司），澳天力牌牛初乳咀嚼片（0.5 g/片，批號(hào)：20171101-01，廣東美麗康保健品有限公司），怡生安康牌美齡丸（3 g/袋，批號(hào)：20180401，河南百消丹華南藥業(yè)有限公司），正官莊牌高麗參精丸[210 mg/粒，批號(hào)：40238001，正官莊六年根商業(yè)（上海）]，均為河南省食品藥檢驗(yàn)所抽檢樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters BEH-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以0.1 %甲酸溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～3 min，88 %～15 %A；3～4 min，15 %A；4～4.5 min，15 %～88 %A；4.5～6 min，88 %A。流速0.4 ml/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量3 μl。

2.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧離子源；電離模式：正離子模式；檢測(cè)方式：MRM-IDA-EPI；MRM掃描模式參數(shù)：氣簾氣（curtain gas）：30 psi；碰撞氣（collision gas）：中等（Medium）；離子化電壓：+5500 V；離子源溫度：600 ℃；噴霧氣：55 psi；輔助加熱氣：55 psi；EPI掃描模式的離子源參數(shù)與以上MRM掃描模式參數(shù)保持一致，各目標(biāo)化合物監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)設(shè)定見表1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別準(zhǔn)確稱取適量上述對(duì)照品，用甲醇配制成500 μg/ml的貯備液，冷藏備用。取對(duì)照品貯備液各50 μl，置于同一25 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。再取混合對(duì)照品溶液適量，用80 %甲醇制成質(zhì)量濃度分別為2，10，25，50，100 ng/ml的混合對(duì)照品溶液。

表1 13種非法添加藥物的保留時(shí)間tR及質(zhì)譜參數(shù)

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品（片劑、丸劑取適量研細(xì)，軟膠囊和硬膠囊取適量?jī)?nèi)容物混勻）0.5 g于50 ml量瓶中，加80 %甲醇適量，超聲30 min，放冷至室溫，再定容至刻度，搖勻，離心（6000 r/min）5 min，取上清，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得，如果檢出且含量較高，可再稀釋適量倍數(shù)。

2.3.3 陰性樣品溶液 取1.2項(xiàng)下膠囊劑、片劑和丸劑的陰性樣品（即13種非法添加藥物成分檢驗(yàn)結(jié)果為陰性的樣品）各2份，按2.3.2項(xiàng)下方法制成3種劑型的陰性樣品溶液。

2.4 方法專屬性考察

取上述陰性樣品溶液、混合對(duì)照品溶液、加標(biāo)陰性樣品溶液，按2.1、2.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣，得到色譜和質(zhì)譜圖，3種溶液的總離子流色譜圖見圖1，MRM定量離子對(duì)色譜圖見圖2。結(jié)果表明，陰性樣品溶液在每個(gè)離子對(duì)通道中均未見有干擾13種成分的色譜峰，且MRM定量離子對(duì)通道之間互不干擾，定量準(zhǔn)確度好。上述3種劑型所含成分均不干擾目標(biāo)物的測(cè)定，方法專屬性較好。

圖1 總離子流色譜圖

圖2 定量離子對(duì)色譜圖

2.5 線性范圍考察

取2.3.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1、2.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣，以目標(biāo)組分定量離子的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。結(jié)果表明，所有化合物在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r均在0.9939～1.0000范圍內(nèi)。

2.6 檢出限（LOD）和定量限（LOQ）

在陰性樣品中添加混合對(duì)照品溶液，用80 %甲醇逐步稀釋后進(jìn)樣，以3倍信噪比計(jì)算各組分的LOD，10倍信噪比計(jì)算各組分的LOQ，結(jié)果見表2。結(jié)果表明方法具有很高的靈敏度，完全滿足非法添加藥物的檢測(cè)要求。

2.7 進(jìn)樣精密度考察

取50 ng/ml混合對(duì)照品溶液，按2.1、2.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣，連續(xù)6次，記錄各非法添加藥物定量離子的峰面積，分別計(jì)算各成分峰面積的RSD，見表2。結(jié)果表明方法進(jìn)樣精密度良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取1.2項(xiàng)下膠囊劑、片劑、丸劑陰性樣品各6份，每份精密稱取0.5 g，分別置于50 ml量瓶中，各分3組，加入適量混合對(duì)照品溶液，按2.3.2項(xiàng)下方法分別制成0.5，2.0，5.0 μg/g添加水平供試品溶液。按2.1、2.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件，進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明膠囊劑基質(zhì)中，非法添加藥物回收率均在70 %～112 %之間，片劑基質(zhì)中，非法添加藥物回收率均在66 %～112 %之間，丸劑基質(zhì)中，非法添加藥物回收率均在66 %～120 %之間，回收率良好。

表2 13種非法添加藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、LOD、LOQ

2.9 精密度試驗(yàn)

采用添加水平為2.0 μg/g的供試品溶液進(jìn)行日內(nèi)和日間精密度試驗(yàn)，按2.1、2.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣。日內(nèi)精密度由每隔2 h重復(fù)測(cè)定6次得到，日間精密度由連續(xù)3 d重復(fù)取樣測(cè)定得到。結(jié)果，日內(nèi)精密度RSD控制在0.7 %～4.0 %；日間精密度RSD控制在1.0 %～5.0 %，表明方法精密度良好。

2.10 樣品測(cè)定

本次研究共收集增強(qiáng)免疫力類保健食品近50批，按2.3.2方法配制樣品溶液，按2.1、2.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定。若樣品溶液中，有組分的色譜峰保留時(shí)間及相對(duì)豐度比與對(duì)照品一致，則可初步判定為檢出該組分，然后與譜庫(kù)中對(duì)應(yīng)化合物子離子譜圖對(duì)比，進(jìn)一步判斷。根據(jù)定量離子對(duì)的色譜峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中各非法添加藥物的含量。結(jié)果50批樣品中，有1批檢驗(yàn)出西地那非，含量為24.3 mg/g，其余均未檢出。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究考察了常用的Waters BEH-C18色譜柱和Waters T3色譜柱[10]在水-乙腈、0.1 %甲酸水溶液-乙腈、0.1 %甲酸水溶液-0.1 %甲酸乙腈溶液、10 mmol/L乙酸銨-乙腈4種流動(dòng)相體系中的保留效果、峰型和質(zhì)譜響應(yīng)等，結(jié)果表明，C18柱明顯優(yōu)于T3柱；添加甲酸可明顯提高質(zhì)譜的響應(yīng)值，以0.1 %甲酸水溶液-乙腈和0.1 %甲酸水溶液-0.1 %甲酸乙腈溶液流動(dòng)相體系最佳，且兩種流動(dòng)相體系的質(zhì)譜響應(yīng)值無(wú)明顯差別。綜上，采用Waters BEH-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和0.1 %甲酸水溶液-乙腈流動(dòng)相體系，保留效果、峰型等均滿足實(shí)驗(yàn)要求。最后對(duì)梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化，保證了在短時(shí)間（6 min）內(nèi)所有化合物得到較好的分離。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本次研究利用了ITMS的特點(diǎn)，采用MRMIDA-EPI掃描模式。該掃描模式分為兩步，首先采用MRM掃描模式，比較了正、負(fù)離子模式下13種非法添加藥物的質(zhì)譜響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)正離子模式下，響應(yīng)更好，故選擇正離子模式。選擇合適的母離子，并在不同碰撞能量下對(duì)子離子進(jìn)行優(yōu)化，選擇2個(gè)響應(yīng)高且穩(wěn)定的子離子，最后再對(duì)2個(gè)子離子的碰撞能量和去簇電壓進(jìn)行優(yōu)化，并將響應(yīng)相對(duì)較高的子離子作為定量離子，另一個(gè)作為定性離子。然后在EPI模式下，發(fā)現(xiàn)去簇電壓為50 V，碰撞能量為35 V時(shí)，能得到滿意的增強(qiáng)子離子掃描圖。

3.3 譜庫(kù)的建立

取50 ng/ml混合對(duì)照品溶液，按2.1、2.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣，利用得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)建立13種添加物的二級(jí)質(zhì)譜圖譜庫(kù)，見圖3。

表3 13種非法添加藥物回收率

圖3 13種非法添加藥物的增強(qiáng)子離子掃描質(zhì)譜圖

在實(shí)際進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)，采用MRM-IDA-EPI模式，首先進(jìn)行MRM檢測(cè)，可根據(jù)定性離子和定量離子的質(zhì)譜圖對(duì)樣品進(jìn)行第一步定性和定量。當(dāng)某個(gè)通道探測(cè)掃描采集到的信號(hào)強(qiáng)度超過(guò)預(yù)設(shè)值時(shí)（即“出現(xiàn)色譜峰”），系統(tǒng)會(huì)觸發(fā)EPI檢測(cè)，獲得二級(jí)質(zhì)譜圖。將二級(jí)質(zhì)譜圖與建立的譜庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，并給出兩者的相似程度結(jié)果，達(dá)到進(jìn)一步的定性，避免“假陽(yáng)性”現(xiàn)象。如圖4為2.9項(xiàng)下檢測(cè)出西地那非的增強(qiáng)子離子掃描質(zhì)譜圖，圖5為樣品與譜庫(kù)對(duì)比圖，與譜庫(kù)中西地那非增強(qiáng)子離子掃描質(zhì)譜圖對(duì)比，相似度為88.6 %，進(jìn)一步定性為西地那非。

圖4 樣品中西地那非的增強(qiáng)子離子掃描質(zhì)譜圖

圖5 樣品與譜庫(kù)中西地那非增強(qiáng)子離子掃描對(duì)比圖

4 結(jié)論

利用ITMS的IDA掃描模式成功建立了HPLCITMS聯(lián)用法，能快速篩查和同時(shí)測(cè)定增強(qiáng)免疫力類保健食品中非法添加的13種藥物成分。本方法分析時(shí)間短，定性準(zhǔn)確性更高，提高了非法添加檢測(cè)效率，對(duì)規(guī)范保健食品市場(chǎng)有重要意義。