劉洪波,王秋菊,高如意,曹苗苗,
(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司,江蘇 連云港 222001)
銀怡片是針對中老年女性等骨質疏松人群開發(fā)的具有增加骨密度功能的保健食品,由葛根、骨碎補、檸檬酸鈣、硫酸軟骨素等組成。其中葛根、骨碎補經水提、濃縮、干燥得到干膏粉,再與配方中其他原料混合制成片劑。配方中葛根為藥食同源中藥,味甘、辛、涼,歸脾、胃、肺經,具有與雌二醇相當?shù)目构琴|疏松作用,為預防和治療女性閉經后骨質疏松癥安全而有效的原料[1-4]。骨碎補為可用于保健食品的中藥,味苦性溫,歸肝、腎經,有補腎強骨、調節(jié)骨代謝的功能,廣泛用于預防和治療骨質疏松癥[5-8]。本實驗應用G1-熵權法結合正交試驗,以加水量、提取時間和提取次數(shù)為考察因素,以葛根素、總黃酮提取量和出膏率為評價指標,優(yōu)選銀怡片的最佳水提工藝,以期篩選出合理可行的工藝參數(shù),為其進一步生產及應用奠定基礎。
98-1-B型電子調溫電熱套(天津泰斯特);UV-2700紫外分光光度計(日本島津);Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫);JY電子天平(深圳華測);HWS26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒)。
葛根素對照品(含量:95.5 %,中國食品藥品檢定研究院,批號110857-201412);蘆丁對照品(含量:92.6 %,中國食品藥品檢定研究院,批號10080-201409),甲醇(色譜純,上海星可),其他試劑為分析純,水為去離子水。
葛根(批號 Y1708051,產地:陜西)為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi的干燥根;骨碎補(批號Y1709052,產地:貴州)為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei(Kunze) J.Sm.的干燥根莖。
按配方稱取葛根138 g,骨碎補138 g,置入5000 ml圓底燒瓶,加12倍水回流提取2次,每次2 h。濾過,合并提取液,即得。
2.2.1 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相甲醇-水溶液(25:75),檢測波長250 nm,柱溫30 ℃,進樣量10 μl,流速1.0 ml/min。理論塔板數(shù)按葛根素峰計算應不低于4000。
2.2.2 對照品溶液的制備 取葛根素對照品適量,精密稱定,加30 %乙醇制成3.091 mg/ml 溶液,即得。
2.2.3 供試品溶液的制備 取2.1項下提取液,搖勻,0.22 μm微孔濾膜(水膜)濾過,取續(xù)濾液即得。
2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按2.1項提取方法制備葛根陰性提取液,供試品溶液制備方法同2.2.3項,得陰性樣品溶液。
2.2.5 專屬性實驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μl,按2.2.1項色譜條件測定,結果顯示,陰性無干擾。
圖1 對照品(A)、供試品(B)、陰性樣品(C)的HPLC圖譜
2.2.6 線性關系的考察 精密吸取2.2.2項下對照品溶液1.0,2.0,4.0,6.0,8.0 ml,置入10 ml量瓶,以30 %乙醇定容,按2.2.1項色譜條件測定色譜峰面積,以對照品濃度C(μg/ml)為橫坐標,峰面積(A)為縱坐標,繪制標準曲線,葛根素回歸方程為A=44 715C-215.93,R2=0.9999,在0.3091~2.4728 mg/ml濃度范圍內,葛根素峰面積值與濃度具有良好線性關系。
2.2.7 精密度試驗 取葛根素對照品溶液(0.6182 mg/ml),注入高效液相色譜儀,連續(xù)進樣6次,峰面積RSD為0.59 %,表明儀器精密度良好。
2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液,按2.2.1項色譜條件,分別于0,2,4,6,8,12,24 h進樣檢測,結果葛根素的峰面積RSD為1.09 %,表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。
2.2.9 重復性試驗 取2.1項下提取液,按2.2.3項下方法制備供試品溶液,平行6份,按2.2.1項色譜條件測定,結果葛根素含量均值為0.8365 mg/ml,含量RSD為0.27 %,表明方法重復性良好。
2.2.10 加樣回收率試驗 精密吸取已測含量的提取液2.5 ml,置入5 ml量瓶,平行6份,分別精密加入2 mg/ml葛根素對照品溶液1 ml,加水定容至刻度,按2.2.3項下方法制備供試品溶液,按2.2.1項色譜條件測定,計算葛根素回收率,平均回收率為99.87 %,RSD為0.88 %。說明該檢測方法準確,符合要求。
2.3.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品適量,精密稱定,加甲醇溶解,制成濃度為52.78 μg/ml的對照品儲備溶液。精密吸取儲備溶液3.0 ml于10 ml量瓶,加甲醇至刻度,搖勻,即得濃度為15.834 μg/ml的對照品溶液。
2.3.2 供試品溶液的制備 吸取2.1項下提取液2 ml于蒸發(fā)皿中,加入1 g聚酰胺粉吸附,水浴揮干,然后轉入層析柱。先用20 ml石油醚(30~60 ℃)洗,棄去石油醚液,然后用甲醇洗脫,定容至25 ml,即得。
2.3.3 檢測波長的選擇 取蘆丁對照品(15.834 μg/ml)、供試品、空白(甲醇)3種溶液,在200~500 nm范圍內進行掃描,觀察各溶液最大吸收波長。由圖2可知,蘆丁對照品溶液、供試品溶液的最大吸收波長分別為359和375 nm,且在360 nm處有較大吸收,而空白溶液在此波長下無吸收?!侗=∈称窓z驗與評價技術規(guī)范》(2003年版)中“保健食品中總黃酮的測定”中規(guī)定的檢測波長為360 nm,故以360 nm為檢測波長測定總黃酮含量。
圖2 總黃酮紫外掃描圖
2.3.4 線性關系的考察 精密吸取2.3.1項下對照儲備溶液0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 ml置入10 ml量瓶,加甲醇至刻度,搖勻,即得濃度分別為0,5.278,10.556,15.834,21.112,26.390,31.668 μg/ml系列標準溶液,用紫外分光光度計于波長360 nm處分別測定吸收度值。以濃度(C)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標,繪制標準曲線,得蘆丁回歸方程為A=0.026C+0.004,R2=0.9990,線性范圍5.278~31.668 μg/ml。
2.3.5 精密度試驗 取蘆丁對照品溶液(15.834 μg/ml)于360 nm處測定吸光度,連續(xù)測定6次,吸光度RSD為0.07 %,表明儀器精密度良好。
2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液,于0,30,60,90,120,150 min時測定吸光度,吸光度RSD為0.04 %,表明供試品溶液在150 min內穩(wěn)定。
2.3.7 重復性試驗 取2.1項下提取液,按2.3.2項下方法制備供試品溶液,平行6份,測定吸光度,結果總黃酮含量均值為12.016 μg/ml,含量RSD為0.05 %,表明方法重復性良好。
2.3.8 加樣回收率試驗 精密吸取已測含量的提取液2.5 ml,置入5 ml量瓶,平行6份,分別精密加入31.668 μg/ml蘆丁對照品溶液1 ml,加水定容至刻度,按2.3.2項下方法制備供試品溶液,測定吸光度,計算總黃酮回收率,平均回收率為98.82 %,RSD為1.76 %。表明該檢測方法準確,符合要求。
精密量取供試品V1(ml),置入已恒定質量的蒸發(fā)皿(M1)中,在水浴鍋上蒸至近干,轉移至烘箱內,105 ℃干燥至恒定質量,取出,置干燥器中冷卻至室溫,迅速精密稱定質量(M2),計算出膏率。
出膏率=(M2-M1)V2/mV1
式中m為供試品中生藥總質量,V2為供試品的總體積。
在預試基礎上,按照配方稱取276 g藥材飲片,共9份,以加水倍量(A)、提取時間(B)和提取次數(shù)(C)為考察因素,以葛根素提取量(供試品中葛根素的質量/對應葛根藥材的質量)、總黃酮提取量(供試品中總黃酮的質量/對應處方藥材的質量)和出膏率的綜合評分為評價指標,按L9(34)正交試驗因素水平表進行試驗,采用G1-熵權法計算各指標權重,進行提取工藝優(yōu)化。因素水平見表1。
表1 正交試驗因素水平
根據(jù)G1法,對3項評價指標的重要程度進行排序,其順序關系為葛根素提取量>總黃酮提取量>出膏率,并確定各指標的權重評價標度為r2=1.4,r3=1.2,由下列計算公式(1)~(2)求得各指標的主觀權重值w1。根據(jù)各提取工藝試驗數(shù)據(jù),采用公式(3)~(5)計算各指標客觀權重值w2。采用公式(6)計算各指標的組合權重w,采用公式(7)最終求得各評價對象的綜合評分[11]。各指標權重見表2,結果見表3,方差分析見表4。
由表3可知,各因素對綜合指標的影響主次順序為C>B>A,即提取次數(shù)>提取時間>加水倍量,由表4可知,C因素差異有統(tǒng)計學意義,提取次數(shù)3水平最佳,A和B因素差異無統(tǒng)計學意義,選擇加水倍量10倍,提取時間1.5 h。綜合直觀分析和方差分析結果,最佳提取工藝為A2B2C3,即每次加10倍量水,提取3次,提取時間為每次1.5 h。
表2 提取工藝評價指標權重值
表3 正交試驗安排及結果
表4 綜合評價指標的方差分析
為確證該工藝的穩(wěn)定性,按配方稱取葛根、骨碎補飲片各138 g,共3份,根據(jù)優(yōu)選的工藝條件進行3批驗證試驗,結果見表5。
表5 驗證試驗結果
由表5可見,3批驗證數(shù)據(jù)無顯著差異,表明優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定可行。
在提取工藝中,G1-熵權法既可反映各評價指標在不同提取條件下的變化規(guī)律,又可同時兼顧決策者的主觀性,提高了數(shù)據(jù)的合理性和結果的科學性,故本研究采用G1-熵權法對葛根素提取量、總黃酮提取量和干膏率3個評價指標進行賦權,計算其綜合評分。
采用傳統(tǒng)的水提工藝提取銀怡片中葛根、骨碎補,通過現(xiàn)代技術對其提取工藝進行篩選,最終確定提取工藝參數(shù)。驗證試驗結果表明,優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定可行,為銀怡片的進一步開發(fā)及工業(yè)化生產奠定了基礎。