何衍彪 吳婧波 趙艷龍③

(1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所 廣東湛江 524091;2 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 湖南婁底 417000)

菠蘿潔粉蚧Dysmicoccus brevipes（Cock‐ erell） 隸屬于半翅目 （Hemiptera）、粉蚧科（Pseudococcidae），在世界各菠蘿產(chǎn)區(qū)均有分布［1-3］。菠蘿潔粉蚧是菠蘿重要病害—菠蘿凋萎病的主要傳播媒介，已在國內(nèi)外引起廣泛關(guān)注［4-6］?；瘜W(xué)防治是控制菠蘿潔粉蚧的重要措施，種苗浸泡處理效果尤其明顯［7］。殺撲磷（methidathion）又名速撲殺，由瑞士汽巴嘉基公司開發(fā)的廣譜、高效有機磷農(nóng)藥，具有較強的觸殺和胃毒作用，是園林植物、果樹等經(jīng)濟作物介殼蟲常見的防治藥劑［8］。有機磷類殺蟲劑進入生物體后，所發(fā)生的生物轉(zhuǎn)化主要是初級代謝中的氧化反應(yīng)和水解反應(yīng)，以及一些次級代謝（軛合代謝），這些代謝需要細胞色素P450 酶系（P450s）、羧酸酯酶（CarEs）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）等解毒酶的參與［9-10］。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）是從整體轉(zhuǎn)錄水平系統(tǒng)研究基因轉(zhuǎn)錄圖譜并揭示復(fù)雜生物學(xué)通路和性狀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分子機制的學(xué)科［11］。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-Seq）可以全面快速地獲取某一物種個體、特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本，反映出它們的表達水平，是分析生物對不同外部環(huán)境分子響應(yīng)機制的重要手段。鑒于菠蘿潔粉蚧目前無公布基因組圖譜，本研究采用RNA-seq 高通量測序的方法分別對清水處理和殺撲磷藥液處理的菠蘿潔粉蚧的轉(zhuǎn)錄組進行了測序，并利用生物信息學(xué)的方法對所得unigene進行功能注釋和功能分類，以便獲得殺撲磷藥劑處理和非處理的菠蘿潔粉蚧轉(zhuǎn)錄組信息，研究菠蘿潔粉蚧在轉(zhuǎn)錄水平上對有機磷殺蟲劑的響應(yīng)，為深入研究昆蟲的解毒機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試昆蟲：在廣東省農(nóng)墾豐收糖業(yè)發(fā)展有限公司菠蘿生產(chǎn)基地，從植株根部采集菠蘿潔粉蚧，用“南瓜＋蛭石”的方法進行室內(nèi)飼養(yǎng)［3］；動物RNA提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

參照何衍彪［12］毒力測定結(jié)果，分別取致死中濃度（LC50）藥液和清水浸泡30 s 的菠蘿潔粉蚧雌蟲50 頭（2 齡若蟲、成蟲各25 頭），用濾紙吸干蟲體表面的水分，24 h 后置于液氮中，用動物RNA 提取試劑盒提取總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將樣品管置于干冰中送廣州基迪奧生物科技有限公司測序。

1.2.2 cDNA文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序

用帶有Oligo（dT）的磁珠富集樣品mRNA，向得到的mRNA 中加入Fragmentation Buffer 使其片斷化，再以片斷化的mRNA 為模板，用六堿基隨機引物合成cDNA 第一鏈，隨后通過DNA 聚合酶I、RNase H、dNTPs 及緩沖液合成cDNA 第二鏈，再用QiaQuick PCR 試劑盒純化，加EB 緩沖液洗脫，經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A、連接序接頭，最后用瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段并進行PCR擴增。建好的文庫用Illumina HiSeqTM4000進行測序。

1.2.3 序列組裝與功能注釋

按照無參考基因組的樣本進行分析。用Trinity 軟件將過濾后的reads 拼接成轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄本去冗余后得到Unigene；利用blastx將組裝出來的 Unigene 序列與 Nr、SwissProt、KOG 和 KO 四個數(shù)據(jù)庫進行比對，以每個Unigene在數(shù)據(jù)庫中相似度最高的那一條序列為對應(yīng)的同源序列，并確定同源序列所屬物種，統(tǒng)計比對到各個物種的同源序列數(shù)量［13］。

1.2.4 差異表達基因分析

根據(jù)樣本基因表達水平，利用EdgeR軟件進行基因差異表達分析，篩選受殺撲磷誘導(dǎo)表達的基因（判斷標準為偽發(fā)現(xiàn)率小于0.05，差異倍數(shù)兩倍以上）。然后對差異表達基因進行GO分類和KEGG代謝通路富集分析［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序與序列組裝

構(gòu)建文庫用Illumina HiSeqTM4000 測序，殺撲磷藥液處理組（NN-Y）和對照組（NN27）測序分別獲得9.30 G 和10.04 G 數(shù)據(jù)量，GC 含量分別為39.17%和39.22%，其Q30（錯誤率小于0.1%的堿基占比）分別為94.98%和94.99%。對測序得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)進行de novo組裝，獲得了52 806 Unigene （其 中 15 890 個 Unigene 在 Nr、 Swis‐sProt、KOG和KO四個數(shù)據(jù)庫中有注釋），平均長度分別為1 007 bp，N50為2 270 bp。

2.2 差異表達基因分析

通過差異表達基因數(shù)據(jù)分析，與清水處理的對照組（NN27）相比，殺撲磷藥液處理組（NN-Y）中共發(fā)現(xiàn)8 389 個差異基因（DEGs），其中表達量上調(diào)的有3 068 個，下調(diào)的有5 321 個（圖1）。與抗逆、解毒相關(guān)的差異表達基因中，下調(diào)的基因數(shù)量明顯多于上調(diào)的基因數(shù)量。其中乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase）相關(guān)差異表達基因下調(diào)和上調(diào)的基因數(shù)量分別為4 個和1 個，細胞色素P450（Cytochrome P450）相關(guān)差異表達基因下調(diào)和上調(diào)的基因數(shù)量分別為25 個和11 個，羧酸酯酶（Carboxylesterase）相關(guān)差異表達基因下調(diào)和上調(diào)的基因數(shù)量分別為12 個和3 個，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase）相關(guān)差異表達基因下調(diào)的基因數(shù)量和上調(diào)的基因數(shù)量分別為13個和4個（表1）。

表1 部分與抗逆、解毒相關(guān)的差異表達基因

續(xù)表1 部分與抗逆、解毒相關(guān)的差異表達基因

2.3 差異表達基因富集分析

Gene Ontology 中生物學(xué)可以分為生物學(xué)過程（biological process）、 細 胞 組 分 （cellular component）和分子功能（molecular function）3部分，某一差異基因可能同時屬于多個功能類別。富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因中參與生物學(xué)過程的差異基因有1 125 個，其中參與細胞和新陳代謝過程、單組織過程的差異基因所占比例較高；參與細胞組分的差異基因有552個，其中細胞、細胞組分、細胞膜的差異基因所占比例較高，其余組分比例較低；參與分子功能的差異基因有722 個，大多數(shù)表現(xiàn)為結(jié)合和催化活性。生物學(xué)過程、細胞組分和分子功能三部分下調(diào)的差異基因數(shù)量分別為811 個、436 個和501 個，下調(diào)的差異基因數(shù)量明顯多于上調(diào)差異基因數(shù)量（圖2）。

對NN27、NN-Y 兩個種群樣本差異表達基因進行KEGG 代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)在脂肪酸代謝（Fatty acid metabolism）、淀粉與蔗糖的代謝（Starch and sucrose metabolism）、 溶 酶 體（Lysosome）、甘油酯代謝（Glycerolipid metab‐olism）、神經(jīng)活性配體受體相互作用（Neuroac‐tive ligand-receptor interactiom）和類固醇生物合成（Steroid biosynthesis）等代謝通路顯著富集（圖3）。

與清水處理的對照組（NN27）相比，殺撲磷藥液處理組（NN-Y）關(guān)于類固醇生物合成通路上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別為34 個和3 個，關(guān)于神經(jīng)活性配體受體相互作用通路上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別為28 個和1 個，關(guān)于甘油酯代謝通路上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別為34 個和2 個，關(guān)于溶酶體通路上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別為9 個和39個，關(guān)于淀粉與蔗糖的代謝通路上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別為13 個和27 個，關(guān)于脂肪酸代謝上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別為10個和18個。

3 討論

轉(zhuǎn)錄組分析為挖掘昆蟲功能基因提供了有效方法，促進了昆蟲食性轉(zhuǎn)化、生理適應(yīng)、協(xié)同進化等分子機制研究［15］。本研究利用RNA-Seq 高通量測序技術(shù)，研究了殺撲磷藥液處理和清水處理菠蘿潔粉蚧的差異表達基因，并對差異基因的蛋白的分類、功能及代謝通路做了初步的解析。發(fā)現(xiàn)參與分子功能的基因大多體現(xiàn)在結(jié)合和催化活性方面，在脂肪酸代謝、淀粉與蔗糖的代謝、溶酶體、甘油酯代謝、神經(jīng)活性配體受體相互作用和類固醇生物合成等代謝通路顯著富集。

與清水處理組相比，殺撲磷藥液處理組菠蘿潔粉蚧表達量下調(diào)的總差異基因數(shù)明顯多于表達量上調(diào)的與乙酰膽堿酯酶、細胞色素P450、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等抗逆、解毒相關(guān)的下調(diào)的差異表達基因數(shù)也明顯多于上調(diào)基因的，但關(guān)于類固醇生物合成和神經(jīng)活性配體受體相互作用通路中上調(diào)差異表達基因數(shù)明顯多于下調(diào)基因。

昆蟲對殺蟲劑的應(yīng)激反應(yīng)有助于昆蟲抗藥性的研究，但昆蟲對殺蟲劑的應(yīng)激反應(yīng)有別于昆蟲抗藥性，是昆蟲在短時間內(nèi)的一種動態(tài)反應(yīng)，而昆蟲抗藥性是在長期的自然選擇過程形成的對殺蟲劑的適應(yīng)性。前人研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲對殺蟲劑的應(yīng)激反應(yīng)跟殺蟲劑的處理劑量有關(guān)。乙酰膽堿酯酶活性隨甲維鹽處理劑量增加時，對斑翅果蠅和黑腹果蠅成蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性均具有一定的抑制作用，低劑量甲維鹽處理斑翅果蠅成蟲后，乙酰膽堿酯酶活性明顯升高［16］。本研究中乙酰膽堿酯酶等相關(guān)抗逆、解毒基因表達量以下調(diào)為主，這可能與以致死中濃度（LC50）殺撲磷藥液浸泡30 s 的處理方式有關(guān)。殺撲磷對菠蘿潔粉蚧處理時間相對較長，使菠蘿潔粉蚧得以與殺撲磷藥液充分接觸，導(dǎo)致試蟲承載的藥劑劑量相對較高。殺撲磷藥液浸泡處理不同時間對菠蘿潔粉蚧相關(guān)基因應(yīng)激反應(yīng)的影響有待于進一步研究。