許文勝，崔麗霞，劉雄偉，劉明吉，閆 嬌，張 濤

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭 014010；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院圖書館；3.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院2018級(jí)研究生；4.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)生處；5.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院)

早期人類對(duì)低氧的研究并不多，人們發(fā)現(xiàn)缺氧導(dǎo)致呼吸困難，主要集中在暴露于低氧大氣中的高原土著人，除了成功地適應(yīng)大氣低氧外，他們的體內(nèi)平衡能力沒有增加[1]?；魻柕そ?jīng)研究認(rèn)為與所謂的物理化學(xué)的大腦有關(guān)，組織細(xì)胞對(duì)缺氧的獲得性耐受被認(rèn)為是通過進(jìn)化發(fā)展起來的[2]。隨后，隨著缺氧動(dòng)物模型建模成功，從行為學(xué)、神經(jīng)生理學(xué)、神經(jīng)化學(xué)、神經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的角度探討缺氧。公認(rèn)為缺血、低氧(Ischemia/Hypoxia Preconditioning,I/HPC)預(yù)適應(yīng)指機(jī)體預(yù)先受一次或多次短暫、非致死性缺血/低氧刺激,再恢復(fù)常態(tài)后,從而獲得對(duì)更嚴(yán)重甚至致死性缺血或缺氧有更強(qiáng)的抵抗能力，是臨床常見的基本病理過程和死因[3-4]。HPC能導(dǎo)致細(xì)胞基因表達(dá)和炎癥因子分泌的改變，從而參與炎癥反應(yīng)。這是低氧導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織損傷的原因之一，也是腫瘤炎癥微環(huán)境的重要因素，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂,誘發(fā)一系列問題而出現(xiàn)炎癥、損傷、甚至死亡[5-6]。低氧在免疫系統(tǒng)中的作用到目前為止尚不清楚,中樞神經(jīng)系統(tǒng)曾被定義為組織學(xué)上的免疫豁免區(qū)，但越來越多的證據(jù)表明,居留于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞也可分泌各種炎癥介質(zhì)并表達(dá)其受體,啟動(dòng)免疫過程，近年來的研究表明,多種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子參與了腦損傷的發(fā)生發(fā)展及修復(fù)過程[7]。非特異性免疫是人體的第一道防線，吞噬細(xì)胞是非特異免疫中的重要組成部分，本文主要對(duì)吞噬細(xì)胞基本功能進(jìn)行初步的研究。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象與試劑 6～8周雄性昆明小鼠,體重18～22 g。藥品與試劑主要有：75 %乙醇、1640培養(yǎng)液、胎牛血清、PBS緩沖液ConA、小鼠IL-2試劑盒(南京金益柏生物科技有限公司)。培養(yǎng)皿,光學(xué)顯微鏡,無菌紙,廣口瓶,鑷子,眼科剪,橡皮塞,注射器,Ep管,50目鋼網(wǎng),細(xì)胞計(jì)數(shù)板,50 mL離心管，離心機(jī),孔板,光學(xué)顯微鏡,電子秤。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 60只小鼠隨機(jī)分為3組，每組20只。對(duì)照組小鼠不進(jìn)行低氧暴露(H0)、實(shí)驗(yàn)組低氧暴露1次(H1)和低氧暴露4次(H4)，暴露結(jié)束后立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2小鼠低氧預(yù)適應(yīng)模型 低氧預(yù)適應(yīng)模型制備是將小鼠置于125 mL廣口瓶內(nèi)，用橡皮塞密閉，觀察小鼠情況，如出現(xiàn)喘息式呼吸，立即取出，轉(zhuǎn)移到另一相同體積含有新鮮空氣的廣口瓶內(nèi)記錄，同時(shí)記錄低氧耐受時(shí)間，即為低氧暴露1次組(H1)。繼續(xù)進(jìn)行動(dòng)物密閉，觀察、記錄低氧耐受時(shí)間，依次類推進(jìn)行4次，即為低氧暴露4次組(H4)。對(duì)照組不進(jìn)行缺氧暴露，為非低氧暴露組(H0)。低氧結(jié)束后，乙醚麻醉小鼠。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，對(duì)各組小鼠進(jìn)行稱重。

1.2.3免疫器官提取及測量 輕壓小鼠，眼科彎鑷眼靜脈放血處死小鼠，取出置于無菌紙上，腹側(cè)面向上，打開腹腔分離并取出脾臟，放入EP管中，進(jìn)行稱量。胸腺的提取方法同上，分離出胸腺，進(jìn)行稱量。注意不要切斷大血管及弄破心臟，記錄數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。小鼠的胸腺指數(shù)=(胸腺重量/小鼠體重)×10(mg/kg)；脾指數(shù)=(脾重量/小鼠體重)×10(mg/kg)。

1.2.4IL-2活性測定 方法同提取脾的方法，手持鑷子夾住脾被膜，并用hand，S液反復(fù)沖洗，直到脾發(fā)白，收集沖洗細(xì)胞懸液，1 000 轉(zhuǎn)/min×10 min兩次離心，棄去上清，取脾細(xì)胞配制成2×106/mL細(xì)胞懸液，用 1.0 μg/mL的ConA刺激4 h，接種到24孔20 %小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基中，1 mL/孔，置于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中靜置孵育24 h，應(yīng)用ELISA法檢測IL-2活性。

1.2.5小鼠腹腔巨噬細(xì)胞提取與培養(yǎng) 脫頸處死小鼠后，酒精浸泡小鼠1～2 min，移入超凈臺(tái)中，仰臥固定在解剖板上，碘酒消毒腹部皮膚，用鑷子提起下腹皮膚，剪一小口并沿腹中線剪開腹部皮膚，暴露腹部肌層，抽取5 mL預(yù)先預(yù)冷的不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液并注射，注射時(shí)不要損傷內(nèi)臟及血管，用棉球輕柔腹部2-3 min，靜置5 min后，用眼科鑷稍提起腹腔，并用眼科剪剪開一個(gè)小口，用吸管吸取，移入離心管中，并重復(fù)灌洗1次。將兩次回收的洗液分別1 000 轉(zhuǎn)/min×10 min兩次離心，最終棄去上清，調(diào)整細(xì)胞濃度2×106/mL，接種于24孔培養(yǎng)板中，1 mL/孔，置于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中靜置孵育2 h。取上清檢測IL-2的含量，取貼壁細(xì)胞并用RPMI1640培養(yǎng)基洗1～2次，棄去未粘附細(xì)即為單層的巨噬細(xì)胞。取少量細(xì)胞懸液作臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性、并作瑞氏染色。并用墨汁檢測巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1低氧對(duì)小鼠免疫器官的影響 低氧實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒑?，稱取小鼠免疫器官胸腺和脾的重量，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，低氧4次組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均低于對(duì)照組(P<0.05)。低氧會(huì)使免疫器官的相對(duì)指數(shù)下降，低氧1次組與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 低氧對(duì)小鼠對(duì)免疫器官的影響

2.2吞噬細(xì)胞吞噬百分率、吞噬指數(shù)功能的檢測 正常成鼠腦缺氧時(shí)，吞噬細(xì)胞基本功能變化檢測，分別檢測對(duì)照組小鼠、缺氧組1 h和缺氧4 h吞噬百分率及吞噬指數(shù)結(jié)果見表2。

表2 低氧小鼠對(duì)吞噬紅細(xì)胞影響

2.3各組小鼠血液指標(biāo)變化 結(jié)果可見，白細(xì)胞在低氧不同時(shí)間段時(shí)，細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中性粒細(xì)胞在H1、H4與H0相比，中性粒細(xì)胞降低(P<0.05)。紅細(xì)胞則對(duì)低氧最為敏感，不同時(shí)間低氧組與對(duì)照組比較，數(shù)目減少(P<0.05)。

表3 各組小鼠血液主要指標(biāo)的比較

a為與對(duì)照組比較P<0.05

3 討論

應(yīng)激反應(yīng)是機(jī)體突然遭受強(qiáng)烈有害刺激，通過下丘腦引起腺垂體分泌增多，從而促使腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)(Hypothalamus pituitary adrenal,HPA)被激活，糖皮質(zhì)大量分泌，通過下丘腦釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素，垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素，最終導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids,GCs)大量分泌[8]。產(chǎn)生的反應(yīng)是局部或全身的應(yīng)激反應(yīng)，這種反應(yīng)與刺激物無關(guān)，不具有特異性，通常被認(rèn)為有適應(yīng)性意義，但是應(yīng)激對(duì)動(dòng)物有破壞性一面，比如適應(yīng)性疾病，下丘腦-腦垂體-腎上腺皮質(zhì)活動(dòng)增強(qiáng)，這些器官的激素分泌增加，同時(shí)GCs作為HPA系統(tǒng)的終產(chǎn)物，具有免疫抑制作用，可抑制巨噬細(xì)胞(macrophages,Mф)對(duì)抗原的吞噬和處理，抑制淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性及抑制TNF-а、IL-2和IFN-γ的分泌，綜上所述，低氧的極端環(huán)境不僅對(duì)免疫系統(tǒng)有抑制作用，而且對(duì)血液循環(huán)等其他系統(tǒng)也有相對(duì)影響。但數(shù)據(jù)充分證明低氧對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制并不是呈正比的。而是在多次的低氧中產(chǎn)生耐受力。說明機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)是主動(dòng)的。可以積極面對(duì)這種極端環(huán)境。在醫(yī)療領(lǐng)域，我們可以通過低氧調(diào)節(jié)，降低人體代謝率，對(duì)于一些身患絕癥的患者，延長其生存時(shí)間。使其治療時(shí)間延長，可以增加患者的治愈機(jī)會(huì)。

本研究結(jié)果顯示，低氧嚴(yán)重會(huì)對(duì)胸腺脾等免疫器官造成負(fù)面影響。隨著低氧次數(shù)的增加脾和胸腺指數(shù)分別下降11.12 %、0.5 %。實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)隨低氧次數(shù)增加，小鼠在低氧環(huán)境的生存時(shí)間也越長，說明機(jī)體對(duì)極限環(huán)境的抵抗能力也有所提升。結(jié)果可見隨低氧次數(shù)增加，1次低氧巨噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)下降4.61 %、0.2 %。而低氧4次吞噬百分率、吞噬指數(shù)略有減少甚至有升高趨勢，說明吞噬細(xì)胞可能適應(yīng)了低氧環(huán)境的吞噬能反而提升。觀察結(jié)果可見血紅蛋白濃度在第一次低氧中呈上升趨勢，而后又恢復(fù)到正常值。血小板數(shù)目在低氧實(shí)驗(yàn)中變化不大。說明低氧對(duì)機(jī)體凝血功能無影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明淋巴細(xì)胞數(shù)目在低氧環(huán)境中呈下降趨勢，但其對(duì)低氧有一定抵抗能力。綜合本表內(nèi)容，低氧對(duì)于血液營養(yǎng)運(yùn)輸和免疫系統(tǒng)有一定抑制作用，尤其是對(duì)于血液營養(yǎng)運(yùn)輸影響最大，但都限制在一定范圍內(nèi)，說明機(jī)體對(duì)低氧的極端環(huán)境有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)和抵抗能力。