李月玲 鄭薇薇 邵喆

摘要：分子排阻色譜法廣泛用于治療性蛋白質(zhì)藥物的質(zhì)量控制，也是治療性抗體質(zhì)量控制的重要手段。由于色譜柱基質(zhì)與蛋白質(zhì)尤其是聚集體常有非特異性相互作用，質(zhì)量控制的分子排阻色譜法常常低估聚集體的含量，因此用于質(zhì)量控制的SEC方法不一定適用于高聚集體含量樣品的分析。本文希望通過在流動相中添加精氨酸來建立一種更適用于高含量聚集體樣品分析的分子排阻色譜法。文中闡述了該分析方法的建立并對該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明該分析方法的專屬性、精密度和準(zhǔn)確度均符合要求，適合用于高比例聚集體樣品的分析。

關(guān)鍵詞：分子排阻色譜法;聚集體;抗體

【中圖分類號】R-2 ??【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A ??【文章編號】1673-9026（2020）06-091-03

治療性蛋白質(zhì)由于分子本身的復(fù)雜性，往往含有引起免疫原性反應(yīng)的聚集體，給病人帶來嚴(yán)重的安全性風(fēng)險(xiǎn)，所以對于治療性蛋白聚集體的分析在治療性蛋白的質(zhì)量控制中尤為重要[1]。單克隆抗體亦是如此[2]。分子排阻色譜法（SEC）常作為治療性蛋白聚集體比例分析的方法，是治療性蛋白質(zhì)量控制的主要手段之一[3]。但是，由于蛋白質(zhì)與基質(zhì)的非特異性相互作用，導(dǎo)致分子排阻色譜法檢測得到結(jié)果失真。研究表明聚集體更易與基質(zhì)發(fā)生非特異性相互作用，保留在色譜柱內(nèi)而不能被洗脫[4]。影響非特異性相互作用的因素有很多，如色譜柱基質(zhì)類型、流動相的PH和離子強(qiáng)度等[5]。一旦，分子排阻色譜法的一些參數(shù)確定下來，可以利用流動相添加劑來改善聚集體的分離情況。分子排阻色譜法在行業(yè)內(nèi)普遍用于質(zhì)量控制，分析單克隆抗體時(shí)，通常采用0.1M磷酸鹽-0.1M硫酸鈉作為流動相。本文主要研究了在現(xiàn)有方法的基礎(chǔ)上，流動相中添加精氨酸對分子排阻色譜法性能的影響，并對新建立的方法進(jìn)行性方法學(xué)驗(yàn)證。

1.實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1.材料

5個(gè)自主生產(chǎn)的單克隆抗體產(chǎn)品，均為液體制劑。分別編號為IgG-1，IgG-2，IgG-3，IgG-4 、IgG-5和IgG-5H（由IgG-5H的高溫破壞得到）。磷酸二氫鉀和硫酸鈉均購自阿拉丁，鹽酸和氫氧化鈉購自國藥試劑，精氨酸（Arg）購自默克，水為Mili-Q超純水，0.22μm濾器購自密理博。

色譜柱及其保護(hù)柱購自東曹，色譜柱型號TSK gel G3000SWXL（7.8mm×30cm，5μm）;液相色譜儀為安捷倫1260，紫外檢測器。

1.2.方法

樣品準(zhǔn)備，0.1 M Na2SO4-0.1 M KH2PO4溶液稀釋到5.0 mg/ mL。IgG-5置于65℃孵育0.5h、1、2h、3h后獲得高聚集體比例樣品IgG-5H1、IgG-5H2、IgG-5H3、IgG-5H4，檢測前用0.1 M Na2SO4-0.1 M KH2PO4溶液稀釋至5.0 mg/ mL，0.22μm濾器過濾后使用。

優(yōu)化的液相色譜方法參數(shù)，流動相為在0.1M KH2PO4-0.1 M Na2SO4溶液中加入0.4M的精氨酸，pH6.7。進(jìn)樣體積10μL，柱溫25℃，流速1.0 mL/min，等度洗脫20 min，采用面積歸一化法計(jì)算。

1.3.方法驗(yàn)證

參照ICH Q2（R1）指南，分別對方法的專屬性、精密度、準(zhǔn)確度和線性進(jìn)行了考察[6]。方法的專屬性通過聚集體與單體的分離度，以及輔料對檢測的干擾來評價(jià)。方法的準(zhǔn)確度通過不同濃度樣品的檢測結(jié)果與“真值”的偏離來評價(jià)。精密度考察了重復(fù)性和中間精密度。重復(fù)性通過不同濃度的樣品的檢測結(jié)果來評價(jià)，中間精密度通過日間和不同儀器的檢測結(jié)果來評價(jià)。線性通過峰面積相對濃度的線性回歸來評價(jià)。

2.結(jié)果

2.1.方法開發(fā)

2.1.1.精氨酸的添加量

為了研究的流動相中精氨酸添加量，用添加不同量精氨酸的流動相分別分析5種單抗，及1種高聚集體含量樣品。流動相分別含有0M，0.1M，0.2M，0.4M的精氨酸，檢測結(jié)果見圖1。結(jié)果表明精氨酸的添加對5中單抗的分析結(jié)果無影響，但對高聚集體含量樣品IgG-5H的分析結(jié)果影響較大。隨著精氨酸濃度的增加，IgG-5H單體（MP）含量逐漸下降，聚集體（HMW）含量逐漸增加，單體峰面積基本不受影響，聚集體峰面積逐漸增加。故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇在流動相中添加0.4M精氨酸。

2.1.2.流動相中添加0.4 M精氨酸對不同聚集體含量樣品分析的影響

分別用含0 M精氨酸和0.4 M精氨酸的0.1 M Na2SO4-0.1 M KH2PO4溶液做流動相，按2.1方法分析樣品IgG-5、IgG-5H1、IgG-5H2、IgG-5H3、IgG-5H4，檢測結(jié)果見表1。結(jié)果表明，聚集體含量越高的樣品D的絕對值越大，受影響越嚴(yán)重。說明樣品中的聚體更易于基質(zhì)的發(fā)生非特異相互作用，正是這種非特性相互作用導(dǎo)致聚集體含量被低估。

2.2.方法驗(yàn)證

2.2.1.專屬性

取IgG5、IgG-5H3、輔料溶液樣品各1份檢測，結(jié)果顯示該方法可以分離聚集體（HMW）與主峰（MP），且輔料峰不影響檢測。

2.2.2.線性考察

取樣品IgG-5H3，配制1.0 mg/mL，2.5 mg/mL，5.0 mg/mL，7.5 mg/mL，10.0mg/mL，共5個(gè)濃度點(diǎn)。以濃度（橫坐標(biāo)）相對峰面積（縱坐標(biāo)）做線性回歸。結(jié)果顯示主峰和聚集體的線性相關(guān)系數(shù)R2值分別為1.0000和0.9996，證明在1～10mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3.準(zhǔn)確度

取樣品IgG-5H3，配置4.0mg/mL、5.0mg/mL和7.5 mg/mL3個(gè)濃度點(diǎn)的樣品，每個(gè)濃度配置6份，進(jìn)行檢測，取6份結(jié)果的平均值作為結(jié)果。以5.0mg/mL的檢測結(jié)果為真值，計(jì)算各組分比例的差值。結(jié)果表明，在4.0～7.5mg/mL范圍內(nèi)單體、聚集體和低分子差值在1.0%以內(nèi)，準(zhǔn)確度良好。

2.2.4.精密度

取樣品IgG-5H3，配置4.0 mg/mL、5.0 mg/mL和7.5 mg/mL 3個(gè)濃度點(diǎn)的樣品，進(jìn)行檢測，3個(gè)濃度點(diǎn)的聚集體%、單體%和低分子%的RSD分別為1.7%、0.40%和2.8%（見表2的第一次實(shí)驗(yàn)）。重新制備樣品，在不同的儀器上用相同的方法做檢測，兩次實(shí)驗(yàn)聚集體%、單體%和低分子%的總RSD分別為1.7%、0.37%和3.5%。精密度良好。

3.討論

單克隆抗體中的聚集體會引發(fā)免疫原性，危害病人安全。在單克隆抗體的質(zhì)量控制中，利用SEC-HPLC分析產(chǎn)品的聚集體含量對單克隆抗體進(jìn)行質(zhì)量控制，已寫入歐盟藥典。實(shí)驗(yàn)證明，磷酸鹽-氯化鈉流動相在分析低聚集體含量的樣品時(shí)，尚能勝任。但是在分析高聚集體含量的樣品時(shí)，常常造成聚集體含量的低估。本文通過在流動相中添加精氨酸，抑制聚集體與基質(zhì)之間的非特異性相互作用，提高了檢測數(shù)據(jù)的質(zhì)量，使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。所以在分析高聚集體含量樣品或與基質(zhì)非特異性相互作用較強(qiáng)樣品時(shí)，建議在流動相中添加適當(dāng)比例的添加物以得到更可靠的數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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2.M. Vázquez-Rey，D.A. Lang，Aggregates in monoclonal antibody manufacturing processes，Biotechnol. Bioeng. 108 （2011） 1494–1508.

3.Engelsman，J.; Garidel， P.; Smulders，R.; Koll， H.; Smith，B.; Bassarab，S.; Seidl，A.; Hainzl，O.;Jiskoot，W. Strategies for the Assessment of Protein Aggregates in Pharmaceutical Biotech Product Development. Pharmaceutical Research 2010，1–14.

4.Herold M.1993. SEC：Influence of salt concentration in the mobile phase. Am Lab 25：35–38.

5.T. Arakawa，D. Ejima，T. Li，J.S. Philo，The critical role of mobile phase composition in size exclusion chromatography of protein pharmaceuticals，J.Pharm. Sci. 99 （2010） 1674–1692.

6.I.C.H. Q2（R1），Validation of Analytical Procedures： Text and Methodology，2005