何志偉， 錢效森， 羅嵐， 劉毅

(民航總醫(yī)院 呼吸內(nèi)科， 北京 100123)

白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶-M (interleukin-1 receptor-associated kinase-M，IRAK-M)是白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶家族的主要成員之一，是Toll樣受體(toll-like receptor)信號通路的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)先天免疫穩(wěn)態(tài)[1-2]。IRAK-M在肺部主要由樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞等表達[3]。越來越多的證據(jù)表明IRAK-M在哮喘或特應(yīng)性皮炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及炎癥性腸病等多種疾病不同發(fā)展階段對免疫反應(yīng)具有不同調(diào)節(jié)作用[4-8]。人IRAK-M基因由12個外顯子組成，位于12號染色體上(12q14.1-12q15)[9]，由長約65 kb的核苷酸區(qū)域構(gòu)成[10]。IRAK-M已有多個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點被發(fā)現(xiàn)，是目前國際研究哮喘易感性及疾病調(diào)節(jié)基因的重要候選基因之一[11]。目前國內(nèi)尚缺乏IRAK-M基因位點rs1821777多態(tài)性與哮喘易感性及哮喘表型相關(guān)性的研究，因此本研究對成人哮喘患者IRAK-M基因位點rs1821777多態(tài)性進行分析，旨在獲得中國人群相關(guān)位點的資料，研究該位點與哮喘易感性的關(guān)系以及對疾病表型調(diào)節(jié)的重要性。

1 資料與方法

1.1 對象、主要試劑與儀器

1.1.1對象 選取2014—2019年就診呼吸內(nèi)科門診的18～60歲成人哮喘患者541人作為哮喘組，要求符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組制定的支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)(2016年版)[12]，首次就診的哮喘患者，完成全面的病史評價、完成符合質(zhì)量控制要求的肺功能檢查(如肺通氣功能、肺彌散功能、氣道可逆性或乙酰甲膽堿激發(fā)試驗等)；排除患有冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、風(fēng)濕免疫性疾病、高血壓病、嚴(yán)重糖尿病、惡性腫瘤及患有其他呼吸道急慢性疾病等。選取同期體檢中心的健康體檢者514人作為對照組，要求與患者無親緣關(guān)系的漢族健康成年人、無呼吸系統(tǒng)急慢性疾病，完成全面的健康體檢評價、完成符合質(zhì)量控制要求的肺功能檢查；排除過敏、哮喘、或慢性呼吸道疾病等病史，外周血嗜酸粒細(xì)胞水平不在正常范圍內(nèi)，伴其他嚴(yán)重心肺疾病或腦血管疾病。

1.1.2主要試劑和儀器 全血基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，SNaPshot試劑盒ABI PRISM? SNaPshotTMMultiplex Kit(美國ABI公司)，Taq酶TaqHotStart DNA Polymerase(日本Takara公司)；WD-9413B凝膠成像儀(北京六一儀器有限公司)，3730XL測序儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1臨床資料收集 收集2組研究對象的性別、年齡、血常規(guī)檢查結(jié)果、血清免疫球蛋白E(serum immunoglobulin E，sIgE)水平及肺功能測定結(jié)果[包括1 s用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)、FEV1實測值與預(yù)測值比值、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、FEV1/FVC]。

1.2.2基因檢測 抽取2組研究對象空腹外周靜脈血3 mL，置于EDTA抗凝管，提取全血基因組DNA，應(yīng)用SNaPshot法對IRAK-M基因rs1821777位點進行基因分型，使用Primer5軟件設(shè)計引物并進行合成。IRAK-M基因rs1821777位點擴增引物F為5′-AGACAGTTGATTGACTGCAGC-3′、引物長度21 bp，R為5′-TCATCTCTACATGCTCAGCAC-3′、引物長度22 bp；IRAK-M基因rs1821777 位點延伸引物為YS ttttttttttAGAGATAGGTCCACACACAAA，引物長度31 bp。PCR反應(yīng)10 μL體系包括2.5×Buffer 4 μL、擴增引物工作液0.2 μL、Taq(5 U/μL)0.1 μL、dNTP 0.8 μL及DNA 50 ng，加雙蒸水至10 μL；PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，上述3個步驟循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物純化為PCR產(chǎn)物15 μL加入堿性磷酸酶 5 U和核酸外切酶I 2 U，37 ℃消化60 min，75 ℃滅火20 min，4 ℃保存?zhèn)溆?；延伸反?yīng)10 μL體系包括純化的PCR產(chǎn)物1 μL、延伸引物0.2 μmol/L及SNaPshot Reaction Mix 5 μL，加雙蒸水至10 μL；PCR反應(yīng)條件為96 ℃預(yù)變性30 s、96 ℃變性10 s、50 ℃退火5 s、60 ℃延伸30 s，上述3個步驟循環(huán)30次，4 ℃延伸60 s；延伸反應(yīng)產(chǎn)物10 μL，加入堿性磷酸酶0.5 U，37 ℃消化1 h，75 ℃滅火15 min；將所得產(chǎn)物置于ABI 3730XL遺傳分析儀進行檢測，采用Gene Mapper 3.2軟件進行基因分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

哮喘組患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞比例及血清IgE(經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換后)水平均高于對照組，F(xiàn)EV1實測值與預(yù)測值比值、FEV1/FVC則均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2組研究對象年齡及性別分布的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組研究對象臨床資料Tab.1 Comparison of the general information

2.2 基因型和等位基因頻率分布

2組研究對象基因型分布和等位基因頻率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組研究對象IRAK-M基因rs1821777位點的多態(tài)性[n(%)]Tab.2 Polymorphism of IRAK-M gene rs1821777 locus between two groups[n(%)]

2.3 成人哮喘患者rs1821777位點基因型與哮喘臨床表型的關(guān)系

將哮喘患者中rs1821777位點基因型為CC的患者(CC組)與哮喘患者中rs1821777位點基因型為TT或CT的患者(TT+CT組)進行比較，TT+CT組哮喘患者FEV1實測值與預(yù)計值比值、FEV1/FVC較CC組降低，但外周血嗜酸性粒細(xì)胞比例和免疫球蛋白水平(經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換后)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 rs1821777位點基因多態(tài)性對成人哮喘患者臨床特征的影響Tab.3 Effect of the polymorphism of IRAK-M gene rs1821777 locus on adult asthma

3 討論

人類白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶處于模式識別受體Toll樣受體/白介素-1受體信號途徑的中間環(huán)節(jié)，在調(diào)節(jié)機體的自身免疫中起重要的樞紐作用，參與呼吸機肺損傷、酒精性肝損傷、糖尿病、心肌梗塞、結(jié)核、腦卒中、結(jié)腸癌及葡萄膜炎等疾病的發(fā)病[13-20]。許多研究發(fā)現(xiàn)IRAK-M基因與哮喘發(fā)病相關(guān)，但IRAK-M與哮喘的關(guān)系在不同人群中所得到的研究結(jié)果尚不統(tǒng)一[21-24]。意大利研究發(fā)現(xiàn)，包括rs1821777在內(nèi)的4個SNP在哮喘組與對照組患者中存在差別，且IRAK-M與發(fā)病年齡小于13歲的哮喘患者易感性相關(guān)[21]；美國非波多黎各白種人兒童患者中，采用全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(genome-wide association study，GWAS)也發(fā)現(xiàn)，包括rs1821777在內(nèi)的2個SNP與哮喘相關(guān)[22]；墨西哥的GWAS兒童哮喘患者研究結(jié)果不同，未發(fā)現(xiàn)IRAK-M與哮喘相關(guān)[23]；亞洲人群中，日本的研究亦未發(fā)現(xiàn)IRAK-M與哮喘相關(guān)[24]。國內(nèi)尚缺乏IRAK-M與漢族人群哮喘關(guān)系的研究。本研究發(fā)現(xiàn)rs1821777位點基因多態(tài)性在哮喘組與對照組分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但是TT+CT組哮喘患者血清外周血嗜酸性粒細(xì)胞比例及外周血免疫球蛋白水平較CC組哮喘患者升高(P<0.05)，且肺通氣功能比rs1821777 C組哮喘患者更差(P<0.05)，提示IRAK-M基因 rs1821777 位點多態(tài)性參與成人哮喘患者臨床表型調(diào)節(jié)，但與成人哮喘易感性無關(guān)。

IRAK-M參與哮喘發(fā)病及病理生理進展的具體機制研究較少。有研究表明，在卵白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏的大鼠肺中IRAK-M表達明顯增加，IRAK-M基因敲除的大鼠氣道炎癥細(xì)胞浸潤、氣道反應(yīng)較野生型大鼠更明顯、炎癥因子更多、幼稚CD4+T細(xì)胞更多向Th17分化[25]；進一步研究提示，IL-33-PIN1-IRAK-M軸可能是IRAK-M在過敏性哮喘中的具體作用機制之一[26]。過敏性哮喘是Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫疾病，在吸入過敏原的刺激下，氣道上皮細(xì)胞首先產(chǎn)生IL-33，通過TLR/IL-1R信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致T輔助細(xì)胞分泌IL-13等細(xì)胞因子，在細(xì)胞因子的刺激下，脯氨酰順反異構(gòu)酶PIN-1(調(diào)節(jié)因子)被激活，與異構(gòu)化的IRAK-M的突變區(qū)S110A結(jié)合后，導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞IRAK-M核轉(zhuǎn)位及誘導(dǎo)炎癥基因產(chǎn)生[26]。激活的樹突狀細(xì)胞可以誘導(dǎo)T細(xì)胞向TH2細(xì)胞分化，延長嗜酸性粒細(xì)胞的存活、粘附、脫顆粒，從而引發(fā)一系列免疫反應(yīng)[26]。在人體試驗中，通過測定重組塵螨P1 (recombinant dermatophagoides P1 protein，Der-p1) 蛋白處理前后哮喘患者的肺泡灌洗液、活檢標(biāo)本及細(xì)胞刷片免疫染色，發(fā)現(xiàn)處理后的IRAK-M蛋白表達增加，表達IRAK-M的炎癥細(xì)胞增加，PIN1的催化活性增加，IRAK-M下游目標(biāo)炎癥基因表達增加[26]。這與上述動物實驗一致。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)IL-33可能通過作用于人肺成纖維細(xì)胞而導(dǎo)致哮喘的氣道重塑，從而導(dǎo)致哮喘患者FEV1下降[27]。因此有理由推測IRAK-M基因rs1821777位點多態(tài)性可能通過影響IRAK-M蛋白的表達，進而影響氣道重塑和肺功能，但其具體機制需要進一步研究。

綜上所述，本研究表明IRAK-M基因rs1821777位點多態(tài)性與哮喘患者肺功能惡化及嗜酸性粒細(xì)胞持續(xù)高表達有關(guān)，但還需擴大樣本進一步證實上述結(jié)果，并從基因功能方面進一步闡述IRAK-M基因與哮喘的相關(guān)性。