陳思思, 周恒, 王繼春, 謝菁, 周艷麗, 盧帥, 盧力
(武漢大學(xué)人民醫(yī)院 心內(nèi)科, 湖北 武漢 430060; 武漢大學(xué) 心血管病研究所, 湖北 武漢 430060; 心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430060)
β-arrestins是G蛋白偶聯(lián)受體,包含了β-arrestin1與β-arrestin2[1]。β-arrestins是一個(gè)關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)因子,亦可與多種信號(hào)分子直接結(jié)合、并調(diào)節(jié)其活性,參與多種生物活動(dòng)過程[2-4]。除了調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥和免疫反應(yīng)過程,β-arrestins還被發(fā)現(xiàn)是細(xì)胞遷移、凋亡中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5-7]。血管內(nèi)皮功能障礙是許多心血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ),而內(nèi)皮祖細(xì)胞通過遷移、增殖、凋亡等參與了血管內(nèi)皮修復(fù)及新生血管形成過程[8-11]。目前對(duì)β-arrestin2調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞過程中的作用尚不明確,所以本次試驗(yàn)采用基因重組技術(shù)建立β-arrestin2表達(dá)慢病毒載體,系統(tǒng)地研究基因功能對(duì)心血管疾病的作用。
1.1.1質(zhì)粒和病毒 過表達(dá)質(zhì)粒載體為GV492,元件順序Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin,克隆位點(diǎn)為BamHI / AgeI,慢病毒輔助包裝質(zhì)粒為Helper1.0和Helper2.0,由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供。慢病毒包裝細(xì)胞為293T細(xì)胞由美國(guó)ATCC公司提供。
1.1.2主要試劑和儀器 1 kp DNA ladder Marker(美國(guó)Fermentas),In-FusionTMPCR Cloning Kit(美國(guó)Clontech),250 bp DNA ladder Marker(上海捷瑞),瓊脂糖(上海賽百盛),E001-02B Taq polymerase(上海SinoBio),D4030A脫氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)(日本Takara),引物設(shè)計(jì)及合成(上海捷瑞),限制性內(nèi)切酶(美國(guó)NEB),質(zhì)粒抽提試劑盒(美國(guó)Promega),改良伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基(dulbecco modified eagle medium,DMEM)(美國(guó)Hyclone),瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根),胎牛血清(上海微科),胰酶(上?;瘜W(xué)試劑),脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen)及HIV-1 p24 Antigen酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)2.0試劑盒(北京達(dá)科為);聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增儀(美國(guó)Applied Biosystems),凝膠成像儀(上海天能),ABI3730型全自動(dòng)DNA測(cè)序儀(上海美季),HI-9211K型細(xì)菌搖床(太倉(cāng)華利達(dá)),細(xì)菌培養(yǎng)箱(上海一恒),穩(wěn)壓DNA電泳儀(美國(guó)BioRad),Gilson移液器(法國(guó)吉爾森),TGL-16G-A高速離心機(jī)(日本日立)。
1.2.1目的基因片段的獲取 根據(jù)Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)中大鼠Arrb2(β-arrestin2,NM-012911)的cDNA序列,引物由上海捷瑞生物設(shè)計(jì)合成,予以PCR,得到目的基因(表1)。PCR反應(yīng)體系配制:ddH2O、5×PS Buffer和dNTP Mix分別為32.5、10.0和4.0 μL、10 μmol/L上游和下流擴(kuò)增引物均為1 μL、10 mg/L模板和PrimeStar HS DNA polymerase分別1.0和0.5 μL;PCR反應(yīng)條件確定為98 ℃預(yù)變性5 min、98 ℃變性10 s、55 ℃退火10 s及72 ℃延伸90 s,合計(jì)30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸8 min;瓊脂糖凝膠電泳鑒定所得到的PCR產(chǎn)物,再予以回收和純化。
表1 PCR引物序列Tab.1 The sequences of PCR primers
1.2.2建立、鑒定和重組質(zhì)粒法 采用限制性內(nèi)切酶BamHI/AgeI來雙酶切上一環(huán)節(jié)得到的回收純化的PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒,然后將二者實(shí)施連接。PCR產(chǎn)物與載體連接的反應(yīng)體系設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(GAPDH基因的純化PCR產(chǎn)物)、自連對(duì)照組(空載的質(zhì)粒)及實(shí)驗(yàn)組(目的基因的純化PCR產(chǎn)物),將上述連接后的反應(yīng)產(chǎn)物和感受態(tài)細(xì)胞放置在冰上30 min,90 s、42 ℃ 熱激,冰水浴孵育120 s,加LB培養(yǎng)基500 μL,振蕩37 ℃培養(yǎng)60 min;在培養(yǎng)皿上均勻涂上帶有抗生素的菌液,在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)12~16 h。鑒定體系配制為ddH2O和2×Taq Plus Master Mix分別吸取9.2和10.0 μL、10 μmol/L上游和下游引物均為0.4 μL,挑取單個(gè)菌落至鑒定體系中,混勻進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)條件系94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s 及 72 ℃延伸30 s,共22個(gè)循環(huán),72 ℃延伸8 min。鑒定引物(在目的基因和載體上都分別有1個(gè))運(yùn)用于菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子(表1)。鑒定的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子在LB培養(yǎng)基中接種,置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~16 h,得定量菌液展開測(cè)序,再與目的基因序列展開對(duì)比。最后將測(cè)序無(wú)誤的菌液接入LB液體培養(yǎng)基10 mL,置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),時(shí)間為12 h抽提質(zhì)粒。
1.2.3鑒定包裝慢病毒和感染效率 消化處于爆發(fā)式生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞,將細(xì)胞密度調(diào)到3.33×108/L,置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)基包含1/10的血清;至細(xì)胞密度處于70%~80%時(shí)采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h;輔助包裝質(zhì)粒15 μg與GV492-Arrb2重組質(zhì)粒20 μg混合均勻,用DMEM將體積調(diào)整到5 μL,室內(nèi)放置5 min;將稀釋后的質(zhì)粒DNA溶液與加入的Lipofectamine 2000輕輕混合均勻,室內(nèi)放置15 min;將質(zhì)粒DNA/Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到293T細(xì)胞培養(yǎng)液中,混合均勻后放入37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h;換掉培養(yǎng)基為包含10%血清的新細(xì)胞培養(yǎng)基,中途使用PBS清洗,置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48~72 h;收集上層透明液,4 ℃下5 500 r/min離心10 min;0.45 mm的濾器針過濾上層透明液,4 ℃下25 000 r/min離心2 h,棄上清,加病毒保存液充分溶解,10 000 r/min離心5 min,分裝保存至-70 ℃環(huán)境;采用終點(diǎn)稀釋法來測(cè)定病毒滴度,使293T細(xì)胞感染慢病毒,通過熒光顯微鏡鑒定Arrb2重組質(zhì)粒與慢病毒是否已經(jīng)順利成功包裝。
瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果顯示,目的基因擴(kuò)增所得到的的PCR產(chǎn)物大小為1 274 bp,與Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)中該基因片段大小一致,表明了引物序列和擴(kuò)增體系的有效性和準(zhǔn)確性。見圖1。
圖1 目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定Fig.1 PCR amplification product identification of target genes
PCR和凝膠電泳鑒定結(jié)果顯示(圖2),陰性對(duì)照中未見條帶,排除了外源性DNA和載體對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾;陽(yáng)性對(duì)照(GAPDH)和核酸marker說明了擴(kuò)增的有效性;陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR產(chǎn)物大小為728 bp,進(jìn)一步對(duì)比Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)中大鼠Arrb2基因序列,表明上下游引物之間基因序列大小與轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小結(jié)果一致(圖3)。
注:1為陰性對(duì)照(ddH2O),2為陰性對(duì)照(空載自連對(duì)照組),3為陽(yáng)性對(duì)照(GAPDH),4為marker,5~12為Arrb2 1~8號(hào)轉(zhuǎn)化子。圖2 Arrb2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of Arrb2 recombinant plasmid transformant
圖3 Arrb2重組質(zhì)粒測(cè)序比對(duì)結(jié)果Fig.3 Sequence alignment results of Arrb2 recombinant plasmid
慢病毒包裝完成后,采用終點(diǎn)稀釋法測(cè)定病毒滴度為5×1011TU/L;將慢病毒與293T細(xì)胞共孵育,使慢病毒進(jìn)入細(xì)胞中;熒光顯微鏡觀察結(jié)果所示,病毒轉(zhuǎn)染有效的細(xì)胞帶綠色熒光,隨著病毒量增加,轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)逐漸增加,具有較高的感染效率。見圖4。
圖4 Arrb2重組慢病毒感染293T細(xì)胞(200×)Fig.4 The 293T cells infected by Arrb2 recombinant lentivirus (200×)
β-arrestins屬于抑制蛋白arrestin家族成員,參與調(diào)節(jié)許多體內(nèi)病理生理事件的發(fā)生發(fā)展,包括心血管和消化道疾病、泌尿系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等[12-13]。β-arrestins是分子量為47~55 kDa的可溶性蛋白,包含一個(gè)氨基端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)羧基端結(jié)構(gòu)域,兩者由極性核連接形成靜止結(jié)構(gòu),當(dāng)β-arrestins與受體結(jié)合后,極性核被磷酸基團(tuán)干擾,構(gòu)象異構(gòu),β-arrestins即被激活[2,14-16]。β-arrestins最初被認(rèn)為僅僅參與G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)的減敏以及內(nèi)化[5],而近年來的研究發(fā)現(xiàn),β-arrestins作為一種支架蛋白不僅可介導(dǎo)GPCR信號(hào)通路,也可以招募細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子并與之結(jié)合,調(diào)節(jié)其活性,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞遷移、凋亡等過程[6,17-19]。在對(duì)Hela和HEK293細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),β-arrestin2可以結(jié)合趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4),正性調(diào)控CXCR4介導(dǎo)的信號(hào)通路,促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移[20]。此外,有研究報(bào)道,在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中,β-arrestin2可以介導(dǎo)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)激活,上調(diào)白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的表達(dá)[21],而IL-8是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的重要因子[22-24]。上述結(jié)果雖證實(shí)了β-arrestin2對(duì)細(xì)胞遷移及凋亡的生物學(xué)作用,但其對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)節(jié)及在心血管疾病中的作用仍未明確,尚需要更為深入的研究。
基因修飾是目前研究基因功能的重要方法之一,通過選擇適當(dāng)?shù)妮d體使目的基因過表達(dá)或缺失,擬研究目的基因在的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或細(xì)胞模型中的作用[25]。其中,慢病毒載體是基于人類免疫缺陷型病毒發(fā)展起來的基因治療載體,比較容易侵入分裂與非分裂細(xì)胞都,且可以實(shí)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)的持久表達(dá)[26-27]。慢病毒是一種自殺性病毒,中是針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞,不會(huì)侵入其他細(xì)胞,也不會(huì)利用宿主細(xì)胞滋生新興病毒顆粒,是基因修飾的最先考慮的一個(gè)載體,現(xiàn)階段,在基因靶點(diǎn)領(lǐng)域得到的普遍應(yīng)用[28-29]。通過慢病毒載體系統(tǒng),可以將目標(biāo)基因整合至宿主細(xì)胞基因組內(nèi),獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)基因的細(xì)胞株[30-31]。本實(shí)驗(yàn)利用限制性內(nèi)切酶消化獲得線性化載體GV492,PCR擴(kuò)增制備β-arrestin2目的基因片段,并進(jìn)行重組反應(yīng),將線性化載體和目的基因片段體外環(huán)化,再進(jìn)行轉(zhuǎn)化、鑒定及抽提獲取過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒。其中GV492載體的元件順序?yàn)閁bi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin,包含啟動(dòng)子Ubi以保證目的基因的順利表達(dá);3Flag標(biāo)簽則有利于目的蛋白表達(dá)后的檢測(cè),gcGFP為增強(qiáng)的綠色熒光蛋白,是在EGFP的基礎(chǔ)上增加4個(gè)氨基酸殘基突變,其熒光強(qiáng)度比EGFP高出60%以上,可以更好的判斷重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率;而IRES為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn),在病毒翻譯調(diào)控方面起到重要作用,puromycin使質(zhì)粒具有嘌呤霉素抗性,用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。將重組質(zhì)粒及病毒輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,成功構(gòu)建GV492-Arrb2重組慢病毒,濃縮、純化后的慢病毒滴度和傳染效率都較高,為深入研究基因功能對(duì)心血管疾病的作用筑下根基。