李靖， 楊健， 劉亭， 李勇軍， 沈艷珍， 楊暢， 何彬， 王愛民**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 4.貴州維康子帆藥業(yè)股份有限公司， 貴州 修文 550200)

軟組織損傷包括急性軟組織損傷和慢性軟組織損傷，急性軟組織損傷指人體運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、皮膚以下、骨骼之外的組織受到不同致傷因素的作用，造成組織生理功能的暫時(shí)紊亂和組織急性破壞而產(chǎn)生損傷，但無(wú)骨折、脫位等[1-2]，其主要臨床表現(xiàn)為局部疼痛腫脹、局部青紫瘀斑、功能障礙等[3-4]。目前西醫(yī)常采用包扎、封閉或理療等方法進(jìn)行治療，而中醫(yī)則采用外敷、內(nèi)服中藥、針灸和推拿等方法治療，且中醫(yī)藥治療軟組織損傷療效顯著[5-6]。骨康膠囊是貴州傳統(tǒng)苗藥復(fù)方制劑，主要由補(bǔ)骨脂、三七、續(xù)斷、芭蕉根和酢漿草組成，具有滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋壯骨、通絡(luò)止痛等功效[7-8]。臨床上廣泛用于骨性關(guān)節(jié)炎、骨折、骨質(zhì)疏松癥等病癥，療效顯著[9-11]。本課題組前期對(duì)骨康膠囊的藥效及炮制進(jìn)行了系統(tǒng)性研究[12-14]，目前尚未見骨康膠囊促軟組織損傷修復(fù)的報(bào)道，本研究將骨康膠囊及其芭蕉根和酢漿草成分用于大鼠急性軟組織損傷模型，通過(guò)檢測(cè)大鼠組胺含量變化及觀察大鼠肌肉組織病理切片，探討骨康膠囊及其芭蕉根和酢漿草成分的軟組織損傷治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠體質(zhì)量(220±20)g，飼養(yǎng)濕度40%～70%、溫度20～25 ℃的環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.1.2藥品與試劑 骨康膠囊、芭蕉根藥材、酢漿草藥材均由貴州維康子帆藥業(yè)股份有限公司提供，接骨七厘片購(gòu)于湖南金沙藥業(yè)有限責(zé)任公司，0.9%氯化鈉注射液購(gòu)于廣西裕源藥業(yè)有限公司，75%醫(yī)用消毒酒精購(gòu)于貴州鑫源衛(wèi)生制品有限公司，大鼠組胺酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.1.3儀器 超純水機(jī)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)、EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、DH6000BII型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司)、Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)，Thermo公司)、Thermo fresco 17低溫高速離心機(jī)(美國(guó)，Thermo公司)、Leica成像顯微鏡(德國(guó)，徠卡公司)。

1.2 方法

1.2.1建立大鼠急性軟組織損傷模型 造模前1 d 用剃毛刀去除大鼠臀部及大腿毛，用生理鹽水擦拭干凈，在大腿腘窩上2 cm處用記號(hào)筆標(biāo)記。造模前，將SD大鼠用10 %水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射進(jìn)行麻醉，將大鼠左下肢拉直平放，固定在硬木板上，將1根20 cm長(zhǎng)，直徑與砝碼相當(dāng)?shù)目招乃芰瞎艽怪狈胖迷谧笙轮珮?biāo)記處(盡可能靠近標(biāo)記點(diǎn))，然后用重200 g的砝碼，連續(xù)8次從空心管頂端沿空心管自由落體擊中大鼠左下肢標(biāo)記處[15]，造成大鼠左下肢局部急性軟組織損傷(瘀血、腫脹)。除空白組外，其余各組均采用軟組織損傷打擊器(自制)，制造大鼠軟組織損傷模型。肉眼觀察驗(yàn)證造模成功與否：造模區(qū)打擊后出現(xiàn)腫脹、皮下瘀血，但皮膚完整、無(wú)破損，觸摸左下肢無(wú)骨折脫位征象，左下肢明顯跛行，但無(wú)其他異常情況者確定造模成功。

1.2.2分組與給藥 將80只大鼠隨機(jī)分為8組，每組10只，即空白組(蒸餾水1 mL/100 g)、模型組(蒸餾水1 mL/100 g)、接骨七厘片組(陽(yáng)性藥，0.320 g/kg，為成人等效劑量1.2倍)、骨康膠囊[低(0.432 g/kg)、中(0.864 g/kg)、高(1.296 g/kg)]劑量組(分別為成人等效劑量1、2、3倍)、酢漿草組(0.432 g生藥/kg，為骨康膠囊中酢漿草的含量)、芭蕉根組(0.648 g生藥/kg，為骨康膠囊中芭蕉根的含量)。藥物均以蒸餾水配制成混懸液，灌胃容積為1 mL/100 g，連續(xù)給藥7 d，1次/d。

1.2.3測(cè)定大鼠血清組胺 末次給藥后，予大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，血液室溫靜置5 min，2 500 r/min 離心5 min，收集上清，保存、備用。按試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定大鼠血清組胺含量。

1.2.4組織形態(tài)學(xué)觀察 末次給藥后30 min頸椎脫臼處死大鼠，肉眼觀察損傷局部皮下瘀血和肌肉腫脹程度。取損傷中心部位肌肉組織置10%福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察。參照文獻(xiàn)[5,16-17]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。(1)充血、出血：血管大片充血或灶性出血(3分)，血管較多充血(2分)，血管少量充血(1分)，無(wú)充血、出血(0分)。(2)變性壞死：組織大片壞死(3分)，組織廣泛變性(2分)，局部組織變性(1分)，無(wú)變性壞死(0分)。(3)炎癥：大量炎性細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)(3分)，較多炎性細(xì)胞片狀浸潤(rùn)(2分)，少量炎性細(xì)胞散在浸潤(rùn)(1分)，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(0分)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清組胺水平

大鼠造模給藥7 d后，模型組血清組胺含量高于空白組(P<0.05)，而與模型組比較，接骨七厘片組、骨康膠囊(中、高)劑量組血清組胺含量降低(P<0.05)，骨康膠囊低劑量組、酢漿草組、芭蕉根組血清組胺含量無(wú)明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清組胺的變化Tab.1 Changes of serum histamine in

2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

空白組可見正常組織結(jié)構(gòu)肌肉，無(wú)腫脹及變性壞死，無(wú)組織水腫、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維條理清晰；模型組可見大量炎性細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)，出血及肌纖維變性；接骨七厘片組、骨康膠囊(中、高)劑量組可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維排列較整齊；酢漿草組、芭蕉根組可見較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、出血及肌纖維變性。組織形態(tài)學(xué)評(píng)分上，與空白組比較，模型組評(píng)分增加(P<0.01)；與模型組比較，接骨七厘片組、骨康膠囊(中、高)劑量組評(píng)分降低(P<0.05或P<0.01)，且骨康膠囊組呈劑量依賴性降低，而酢漿草組、芭蕉根組評(píng)分變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2和圖1。

表2 各組大鼠組織切片形態(tài)學(xué)評(píng)分Tab.2 Morphological score of rat tissue sections

注：A為對(duì)照組，B為模型組，C為接骨七厘片組，D為骨康膠囊低劑量組，E為骨康膠囊中劑量組，F(xiàn)為骨康膠囊高劑量組，G為酢漿草組，H為芭蕉根組。圖1 各組大鼠軟組織損傷部位HE染色結(jié)果(400×)Fig.1 Observation of soft tissue injury site of rats in each group under light microscope (400×)

3 討論

急性軟組織損傷的病理過(guò)程主要是損傷組織發(fā)生無(wú)菌性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)和促炎細(xì)胞因子釋放[18-19]。組胺是常見的一種炎癥介質(zhì)，當(dāng)組織受到損傷時(shí)便會(huì)釋放組胺，其可通過(guò)H1受體起作用，使細(xì)動(dòng)脈擴(kuò)張，細(xì)靜脈通透性增加，從而加速炎癥反應(yīng)[20-21]。當(dāng)組胺含量降低時(shí)，炎癥反應(yīng)減輕，有利于軟組織損傷修復(fù)。形態(tài)學(xué)是軟組織損傷最基本的觀察指標(biāo)，也是直接反應(yīng)軟組織損傷恢復(fù)情況的指標(biāo)，對(duì)軟組織進(jìn)行HE染色可觀察到血管、組織結(jié)構(gòu)及炎性浸潤(rùn)等恢復(fù)情況[22]。制造急性軟組織損傷的方法較多，因砝碼法具有造模時(shí)間短、成功率高、方法簡(jiǎn)單、成本小以及重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，故本研究采用此方法造模進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[23]，并通過(guò)觀察組胺含量和軟組織形態(tài)，來(lái)考察骨康膠囊對(duì)軟組織損傷的治療作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接骨七厘片組、骨康膠囊(中、高)劑量組大鼠血清中的組胺含量及組織形態(tài)學(xué)評(píng)分均降低，且骨康膠囊的下調(diào)作用呈劑量依賴性。骨康膠囊主要由補(bǔ)骨脂、三七、續(xù)斷、芭蕉根及酢漿草組成[6-7]。據(jù)報(bào)道，酢漿草和芭蕉根具有清熱解毒、消腫止痛、利尿等功效，含黃酮、香豆素等成分，具有較好的抗炎、抑菌和抗病毒作用[24-26]，但骨康膠囊中酢漿草、芭蕉根組分作用尚未明確。為了闡明骨康膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)一步擴(kuò)展其應(yīng)用，本文對(duì)酢漿草和芭蕉根的軟組織損傷修復(fù)作用進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酢漿草組、芭蕉根組大鼠血清中的組胺含量及組織形態(tài)學(xué)評(píng)分均無(wú)明顯變化。說(shuō)明芭蕉根、酢漿草雖然具有較好的抗炎作用，但沒有降低組胺，促進(jìn)軟組織損傷修復(fù)的作用，不是骨康膠囊促進(jìn)軟組織損傷修復(fù)的主藥，其在組方中的作用還有待進(jìn)一步研究。綜上所述，骨康膠囊可促進(jìn)大鼠軟組織損傷修復(fù)，其作用機(jī)制可能是降低受傷局部組胺含量達(dá)到鎮(zhèn)痛、消腫的作用。