蘭詠哲， 李啟瑞， 黃勁， 趙亮， 董宇華， 闞雨， 王迪， 廖萬清， 康穎倩*

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 微生物學教研室， 貴州 貴陽 550025; 2.貴州省微生物與人類健康關系研究人才基地 & 貴州省普通高校病原生物學特色重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 生物化學與分子生物學教研室， 貴州 貴陽 550025； 4.中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學 上海長征醫(yī)院真菌學研究所， 上海 200003)

余甘子(Phyllanthusemblica)為大戟科(Euphorbiaceae)灌木植物[1]，是中國維吾爾族、傣族、壯族及布依族等多個民族的習用藥材[2-3]。余甘子藥用部位主要是果實，目前研究也大多以余甘果為主體[3-5]?，F代藥理學研究證實，余甘子具有廣泛的抗菌能力、抗炎作用及極強的抗氧化能力，并且無明顯的毒副作用[6-9]。內生真菌是指某階段生活于健康植物體內，但不引起植物組織明顯病害癥狀的真菌[10-12]。根據Stierle等[13]提出的“內共生理論”，內生真菌不僅可產生與宿主植物次生代謝產物相同或者相似的物質，還可以產生其它類型的活性物質，對宿主植物生長發(fā)育、對外界環(huán)境的應激耐受性、有效活性成分的產生與積累等方面有重要影響。內生真菌在藥物開發(fā)和生物防治等方面顯示出較好的應用價值[14-17]，可有效緩解藥用植物資源匱乏、栽培藥材品質下降等問題[18]。研究發(fā)現，余甘子果實藥用價值較好[1]，但對其內生真菌的研究還未見報道。因此，本研究通過對余甘子內生真菌進行研究，分析其物種多樣性，同時探究代謝產物的抗菌活性、抗氧化作用及其與余甘子的化學成分的相關性，以期為研究藥用植物內生真菌及開發(fā)新的藥物資源提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1余甘子和菌株 貴州省關嶺縣10月份野生健康成熟新鮮的余甘子果實，置于4 ℃冰箱保存；標準菌株由本校真菌實驗室提供。

1.1.2主要試劑與儀器 Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、Genstar 聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR) MIX、T100 PCR儀及電泳儀(美國 BIO-RAD)、Thermo 17R小型臺式高速離心機及HH-B11恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進)。

1.2 方法

1.2.1內生真菌的分離 取余甘子新鮮果實，采用次氯酸鈉作表面消毒處理：次氯酸鈉(含5%有效氯量)浸泡3 min，無菌去離子水洗滌2次，75%乙醇浸泡1 min，無菌去離子水洗滌3次；進行真菌組織分離[19]，即將果實用無菌手術刀切成直徑0.5 cm大小，無菌條件下將果實塊接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～10 d，連續(xù)觀察到組織塊表面長出真菌后，挑針挑取少量菌絲放到新的PDA培養(yǎng)，同時選取表面消毒最后1次沖洗的無菌去離子水及同批次空白培養(yǎng)基作對照。

1.2.2菌株的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 根據菌落的形態(tài)、菌絲及孢子的形態(tài)進行初步鑒定，并提取全基因組，采用轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)基因通用引物ITS-4(3′-CGTATAGTTATTCGCCTCCT-5′)、ITS-5(3′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-5′)進行PCR擴增，序列送公司測序(上海生工)；獲得的序列結果在美國國立生物技術信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)數據庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行下載與比對，同時構建系統(tǒng)發(fā)育樹，即使用Bioedit 軟件處理測序結果、并進行序列比對，使用Mega 7選擇最佳建樹模型，構建鄰接法(neighbor-joining method，N-J)系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3余甘子果汁制備 按1.2.1對余甘子新鮮果實進行表面消毒處理，采用研磨器研磨取漿，12 000 r/min離心2 min，取上清，為余甘子果汁，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4內生菌發(fā)酵液的抑菌活性測定 將分離獲得的菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基中25 ℃活化3 d，挑取活化后菌絲380 mg轉接到馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)100 mL，25 ℃、180 r/min搖床恒溫培養(yǎng)7 d[20]，9 000 r/min離心15 min，保存上清備用，為發(fā)酵液[21]；采用溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)和PDB培養(yǎng)基對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及白色念珠菌標準株(ATCC25922、ATCC25923、ATCC10231)進行菌株活化[22]；5 000 r/min 離心收集大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的菌體，生理鹽水懸浮菌體并分別對各指示菌菌懸液進行梯度稀釋，稀釋至1×106CFU/mL；取指示菌菌液100 μL分別接種于LB和PDA固體培養(yǎng)基，無菌玻璃涂布棒充分涂布；培養(yǎng)基平板中央貼上已滅菌的濾紙片(直徑5 mm)，并分別滴加發(fā)酵上清液及余甘果果汁20 μL，同時滴加生理鹽水作陰性對照，25 mg/L氯霉素作為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的陽性對照，20 mg/L氟康唑作為白念珠菌的陽性對照；采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.5真菌的抗氧化作用研究[23-24]將分離獲得的菌株用PDA平板培養(yǎng)基活化3 d，無菌打孔器(直徑0.6 cm)取1個菌餅接種于PDB培養(yǎng)基，25 ℃、180 r/min搖床活化7 d；5 000 r/min 離心2 min，獲上清液；取發(fā)酵上清液5 mL，加乙酸乙酯5 mL萃取3 h，取適量乙酸乙酯萃取液進行后續(xù)實驗；配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0及10.0 g/L濃度梯度的維生素C(Vitamin C，Vc)溶液、0.6 mol/L 硫酸、28 mmol/L磷酸鈉及4 mmol/L鉬酸銨溶液，并將其等量混合制為混合液；分別移取上述不同濃度梯度的Vc溶液0.1 mL于試管中，加等量混合液5 mL，95 ℃水浴加熱90 min，取試管冷卻至室溫；以不加入Vc溶液的混合液作為陰性對照，695 nm 波長測定其吸光度，繪制抗壞血酸總抗氧化能力標準曲線；分別取不同內生真菌菌株的乙酸乙酯萃取液0.1 mL，同上述Vc測定方法測定其吸光度，每個菌株重復3次；同1.2.3的方法制備余甘子原漿，分別移取原漿0.1 mL及原漿的乙酸乙酯萃取液0.1 mL，同上法測定。按照Vc標準曲線，計算每毫升發(fā)酵液相當于Vc的量(μg)，同時以未接種內生真菌的空白培養(yǎng)基作為陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 內生真菌的分類鑒定

健康成熟新鮮余甘子果實中分離出內生真菌43株，其中青霉屬(PenicilliumLink)19株、橫梗霉屬(LichtheimiaVuill.)9株、間座殼屬(DiaportheNitschke)11株、葉點霉屬(PhyllostictaPers.)1株、葡萄座腔菌屬(NeofusicoccumCrous, Slippers & A.J.L. Phillips)3株，青霉屬為優(yōu)勢屬(圖1)；青霉屬分離出菌種2個(Penicilliumchrysogenum和Penicilliumchermesinum)，其中P.chrysogenum分離出15株，數量最多，為優(yōu)勢菌種(圖2)。

圖1 43株余甘子內生真菌菌屬的構成Fig.1 The genus composition of 43 endophytic fungi of Phyllanthus emblica

圖2 43株余甘子內生真菌菌種的構成Fig.2 The species composition of 43 endophytic fungi of Phyllanthus emblica

2.2 分離菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

對分離出的內生真菌基于ITS序列進行比對，每個菌屬選擇1個標準菌株，共有分離株43株，標準株5株，構建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹。見圖3。

注：1為青霉屬(Penicillium)，2為橫梗霉屬(Lichtheimia)，3為間座殼屬(Diaporthe)，4為葡萄座腔菌屬(Neofusicoccum)，5為葉點霉屬(Phyllosticta)。圖3 43株菌株基于ITS序列的構建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 43 strains based on ITS sequences

2.3 抑菌活性測試

43株內生真菌培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液上清液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及白念珠菌均無抑制效果，但余甘子果汁對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用，對白念珠菌無抑制效果。見表1。

表1 余甘子果汁對3種標準株抑菌活性Tab.1 Antibacterial activity of P. emblica against three type strains

2.4 抗氧化能力測試

圖4 Vc標準曲線Fig.4 Standard curve of Vc

表2 余甘子內生真菌發(fā)酵液的總抗氧化能力Tab.2 The total antioxidant capacity of endophytic fermentation broth from P. emblica

3 討論

本次研究從貴州關嶺地區(qū)余甘子果實中共分離出內生真菌43株，分屬于5個屬9個菌種，包含青霉屬菌種2個(P.chrysogenum和P.chermesinum)、橫梗霉屬菌種1個(Lichtheimiaornata)、間座殼屬菌種4個(Diaporthehongkongensis、Diaporthepseudophoenicicola、Diaporthemusigena及Diaporthehickoriae)、葡萄座腔菌屬菌種1個(Neofusicoccumocculatum)以及葉點霉屬菌種1個(Phyllostictafallopiae)，提示內生真菌多樣性豐富。在分離出的菌株中，青霉屬分離率為44.18%，其中P.chrysogenum分離出的菌株最多(15株)，為優(yōu)勢菌種。N-J法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，43株內生真菌在種群分布上存在差異，分屬于5個屬的2個門。其中，青霉屬真菌被證明具有分泌多種高活性的脂肪、蛋白質、多糖和木質素等多聚物的酶類的功能，與植物共生時也起著一定的抗菌的作用[25]，但在本研究中未發(fā)現相似的功能，這可能與宿主的種類及宿主環(huán)境有關。此外，橫梗霉屬和間座殼屬占本次分離菌株的20.93%和25.58%，與青霉屬一起作為余甘子內生真菌的優(yōu)勢菌屬，這些菌屬的菌株作為內生真菌也常出現在其他植物中[26-27]。研究表明，這些真菌與植物病原菌有相同的生態(tài)位，在宿主體內相互競爭營養(yǎng)、空間等，使病原菌得不到正常的營養(yǎng)供給而消亡，從而增強宿主抵御病害的能力[28]。

分離得到的43株內生真菌中有2株(YGZ03和YGZ04)展現出較好的抗氧化效果，明顯高于空白對照，其他41株內生真菌也有一定的抗氧化能力，但效果比之前的2株菌低，說明余甘子極高的抗氧化作用可能與它的內生真菌有關，這在其他植物中也有相關報道[13,24]。有研究發(fā)現，余甘子的抗氧化作用主要與其多酚、總黃酮及Vc的含量有關[26]，植物內生真菌往往可以產生與宿主植物次生代謝產物相同或者相似的物質[13]，而這些化合物質與內生真菌代謝產物是否具有相關性，還待進一步研究。

本研究中發(fā)現的2株(YGZ03、YGZ04)具有較好抗氧化作用的內生真菌菌株均屬于葡萄座腔菌屬的N.occulatum種。該菌屬往往被認為是引起植物病害的原因[29]。也有研究發(fā)現葡萄座腔菌屬的一株J11菌株具有產紫杉醇的能力[18]，但該菌屬并沒有作為抗氧化菌株引起人們的注意，而抗氧化性可以有效增強植物的抗逆性，本次研究也發(fā)現了該菌屬作為植物內生真菌的新的功能。

綜上所述，本研究結果表明貴州關嶺地區(qū)余甘子內生真菌資源豐富，分屬于2個門5個菌屬；余甘子果汁具有較強的抑菌能力，但內生真菌無明顯抑菌效果。此外，發(fā)現43株內生真菌均具有一定的抗氧化活性，其中2株抗氧化活性較好。