蘭詠哲， 李啟瑞， 黃勁， 趙亮， 董宇華， 闞雨， 王迪, 廖萬(wàn)清， 康穎倩*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550025; 2.貴州省微生物與人類(lèi)健康關(guān)系研究人才基地 & 貴州省普通高校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 貴州 貴陽(yáng) 550025； 4.中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué) 上海長(zhǎng)征醫(yī)院真菌學(xué)研究所， 上海 200003)

姜黃(Curcumalonga)為姜黃芭蕉目、姜科，屬多年生草本植物[1]，其根莖發(fā)達(dá)，根粗壯，末端膨大呈塊根，廣泛栽培于我國(guó)西南、西北地區(qū)[2]。姜黃在中國(guó)中草藥領(lǐng)域已經(jīng)應(yīng)用了上千年，其特有的姜黃素具抗炎、抑菌、降糖、抗氧化及促進(jìn)創(chuàng)口愈合等多種生物學(xué)活性[3-4]。姜黃藥渣以植物根莖組織為主，含有植物纖維、蛋白質(zhì)、多糖及殘留的藥物成分[5-6]，我國(guó)每年姜黃藥渣的排放量達(dá)3 000萬(wàn)噸[7]。目前，利用投加具有高效降解木質(zhì)纖維素的微生物對(duì)藥渣發(fā)酵堆肥的方式已成為國(guó)內(nèi)外藥渣處理的研究熱點(diǎn)[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，降解木質(zhì)纖維素的主要是絲狀真菌[10]，研究者多用添加外源微生物的方式對(duì)藥渣進(jìn)行發(fā)酵[11-12]，但姜黃藥渣本身具有一定的抑菌作用[13-15]，可能會(huì)抑制一些微生物的生長(zhǎng)，降低發(fā)酵效率。有研究者發(fā)現(xiàn)，可從不同的混合藥渣中分離到具高效水解藥渣中木質(zhì)纖維素的菌株，特別是一些菌株可有效地抵抗周?chē)h(huán)境而頑強(qiáng)地生存，證明從藥渣及其堆放環(huán)境中分離對(duì)藥渣有降解效果的真菌方法是有可行性的[16-18]。在分離方法上，研究者常采用平板劃線(xiàn)、平板稀釋涂布等方法分離生物質(zhì)中真菌[19-21]，但由于姜黃藥渣具有一定的抑菌效果，采用傳統(tǒng)的真菌分離方法效果不佳，難以分離出真菌[14]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，先對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行搖床富集培養(yǎng)，可有效地提高菌株的分離率[21]。此外，采用植物組織分離法對(duì)植物組織塊進(jìn)行預(yù)處理也可以有效地對(duì)植物內(nèi)生真菌進(jìn)行分離[9]。因此，本研究結(jié)合多種方法對(duì)姜黃藥渣真菌分離方法進(jìn)行改良，探究姜黃藥渣中真菌的多樣性，為篩選具有降解姜黃木質(zhì)纖維素能力的真菌菌株，解決姜黃藥渣堆放污染環(huán)境的問(wèn)題打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥渣來(lái)源 從貴州正業(yè)集團(tuán)堆放姜黃藥渣的環(huán)境中，參照文獻(xiàn)[22]采集5處姜黃藥渣樣本。

1.1.2主要試劑與儀器 酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium，YPD；美國(guó)BD)，青霉屬及鏈霉素(上海生工)；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、Genstar PCR MIX、T100 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀及電泳儀(美國(guó) BIO-RAD)，Thermo 17R小型臺(tái)式高速離心機(jī)及HH-B11恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn))。

1.2 方法

1.2.1藥渣真菌常規(guī)分離法 取大小適當(dāng)?shù)慕S藥渣組織塊，無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，置于滅菌的酵母膏胨葡萄糖鏈霉素及青霉屬抗性培養(yǎng)基[18]，25 ℃恒溫?fù)u床孵育3～7 d，每個(gè)樣本重復(fù)3次，將培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株以劃線(xiàn)法接種于YPD固體培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～7 d，分離培養(yǎng)至獲得單一菌種。

1.2.2藥渣真菌改良法 采用植物組織分離法[22]處理姜黃藥渣：取大小適當(dāng)?shù)慕S藥渣組織塊用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次后，用無(wú)菌手術(shù)刀將組織塊切開(kāi)，分成均勻小塊，取直徑0.5 cm的組織塊置于錐形瓶中，加入無(wú)菌ddH2O 150 mL，25 ℃恒溫?fù)u床孵育6 h；將震蕩均勻的菌液靜置30 min，吸取適量上清液，接種于酵母膏胨葡萄糖瓊脂鏈霉素及青霉屬抗性培養(yǎng)基，25 ℃恒溫倒置孵育3～7 d，每個(gè)樣本重復(fù)3次；將培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株以劃線(xiàn)法接種在YPD固體培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫孵育3～7 d，分離培養(yǎng)至獲得單一菌種。

1.2.3菌株的分離及鑒定 分別采用常規(guī)分離方法及改良方法對(duì)5個(gè)姜黃藥渣樣本進(jìn)行菌株的分離，每個(gè)樣本重復(fù)3個(gè)平板；純化后的菌株按Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒的操作步驟提取DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增其轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)基因序列后送公司測(cè)序；將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)中與已知菌株進(jìn)行相似度比較，并結(jié)合菌株的形態(tài)，鑒定種屬[23]，并計(jì)算分離率[24]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 菌株的分離

采用常規(guī)方法和改良方法分別從5個(gè)姜黃藥渣樣本中分離獲得菌株13株和222株，前者分離菌株均數(shù)低于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 常規(guī)方法與改良方法分離的菌株數(shù)Tab.1 Comparison results of two methods for isolate strains

2.2 真菌的多樣性

2種方法分別從姜黃藥渣樣本中分離獲得的真菌菌株13株和222株，常規(guī)方法分離出的13株菌株分屬于2個(gè)門(mén)5個(gè)屬的6個(gè)菌種，改良方法分離出菌株分屬于3個(gè)門(mén)12個(gè)屬的20個(gè)菌種；青霉屬均為優(yōu)勢(shì)菌屬，分離率分別為61.53%、46.84%(圖1)；Aspergillusminisclerotigenes分離出的菌株均最多，分別為5株、58株，為優(yōu)勢(shì)菌種(圖2)。

圖1 常規(guī)方法及改良方法分離菌株的菌屬比例構(gòu)成Fig.1 Composition of the genus ratio of the conventional method and the improved method

圖2 常規(guī)方法及改良方法分離菌株的菌種分布情況Fig.2 Distribution map of strains was isolated by the conventional method and the improved method

3 討論

生物質(zhì)資源具有很高的利用價(jià)值，但生物質(zhì)微生物利用的過(guò)程中往往存在有效菌株難以分離的問(wèn)題，如姜黃藥渣中姜黃素的抑菌作用[3]、酒糟的酸性環(huán)境[23]、茶渣中含有的茶多酚具有較強(qiáng)的抗氧化功效[13]等，這些因素都是導(dǎo)致菌株難以分離的原因。本次研究對(duì)姜黃藥渣真菌的分離方法進(jìn)行了改良，結(jié)合了搖床培養(yǎng)及植物組織分離的方法，其中采用植物組織分離法對(duì)姜黃藥渣進(jìn)行預(yù)處理，可提高藥渣組織各部分與培養(yǎng)基的接觸，并且可以分離出姜黃藥渣中的內(nèi)生真菌，這些真菌往往也具有木質(zhì)纖維素降解能力。此外，以姜黃藥渣為唯一碳源進(jìn)行搖床富集培養(yǎng)，可有效提高菌株的分離率。在本次研究中采用改良方法從采集的5個(gè)姜黃藥渣樣本中分離出真菌菌株222株，每個(gè)樣本分離出的菌株均數(shù)大于常規(guī)平板分離方法(P<0.05)，有效提高了姜黃藥渣真菌菌株的分離率，為中草藥藥渣及其他生物質(zhì)中菌株的分離提供了思路。

本研究中，采用常規(guī)方法及改良方法分別從姜黃藥渣中分離獲得真菌菌株13株、235株，其中曲霉屬分離率分別為61.53%、46.84%，均為優(yōu)勢(shì)菌屬；采用常規(guī)方法分離到的5個(gè)菌屬的6個(gè)菌種，在改良方法中都可以被分離獲得，且優(yōu)勢(shì)菌屬及菌種均未改變，這說(shuō)明改良方法不會(huì)影響樣本中真菌菌株的多樣性。此外，曲霉作為發(fā)酵工業(yè)和食品加工業(yè)的重要菌種，?；钴S在人們的視野之中[24]。在其他生物質(zhì)(如大白花杜鵑根[25]、沙冬青[26])微生態(tài)中，球囊霉屬、無(wú)梗囊霉屬及樹(shù)粉孢屬等菌屬往往為優(yōu)勢(shì)菌屬，與姜黃藥渣存在著一定的差異，這可能與姜黃所特有的性質(zhì)有關(guān)[17]。

本研究還從藥渣中分離出了根毛霉屬、假絲酵母菌屬、紅酵母屬菌、藍(lán)狀菌屬、輪層炭殼屬、傘菌屬、茶葉籽酵母屬、錐毛殼屬、毛霉屬及栓菌屬的菌株。其中，毛霉屬、根毛霉屬主要以腐生的方式生活，具極強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解能力，毛霉屬的一些菌種甚至被報(bào)道過(guò)有降解木質(zhì)纖維素的能力[22]。假絲酵母菌屬為一類(lèi)常見(jiàn)的深部感染真菌，種類(lèi)很多，但能夠引起人類(lèi)致病的僅有幾種，一些菌種也可以利用脫落的植物枝葉進(jìn)行生長(zhǎng)[27]。紅酵母屬的真菌為一些單細(xì)胞真菌，對(duì)周?chē)h(huán)境的適應(yīng)能力很強(qiáng)，可產(chǎn)生莢膜使菌落呈粘稠狀，往往被認(rèn)為是引起動(dòng)植物致病的原因。此外，輪層炭殼屬、傘菌屬、錐毛殼屬及栓菌屬的菌株都常被報(bào)道存在于植物脫落的組織周?chē)?，可有效地利用植物組織生長(zhǎng)，對(duì)木質(zhì)纖維素都具有一定的降解作用[28]。這為后續(xù)進(jìn)一步篩選具有降解木質(zhì)纖維素能力的菌株提供了依據(jù)。