范友羊， 劉俊， 周海燕， 曾家順， 李龍*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腎病風(fēng)濕科， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，其臨床表現(xiàn)特征是身體周圍小關(guān)節(jié)的受累，病理表現(xiàn)多為關(guān)節(jié)周圍的滑膜炎和血管痙攣，關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨被破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)殘疾[1]。全球RA的發(fā)病率為0.5%～1.0%，我國(guó)為0.42%左右，患病人群約有500萬(wàn)，男女患病比例約為1 ∶4，病程1～5、5～10、10～15及≥15年的致殘率分別為18.6%、43.5%、48.1%及61.3%，這表明隨著疾病的進(jìn)展、殘疾及功能受限發(fā)生率升高[2]。雖然RA發(fā)病機(jī)制仍未明確，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CD4+T細(xì)胞的分化和功能障礙是其發(fā)病的重要原因[3-4]。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是體內(nèi)最強(qiáng)大的專職抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)，具有激活免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)免疫耐受的功能，在維持體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)平衡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[5-6]。研究表明，DC的亞群和功能狀態(tài)能直接影響T細(xì)胞的活化和分化，調(diào)節(jié)DC的功能將對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病產(chǎn)生不同的影響[7]。糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是一種多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠平衡促炎或抑炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并影響免疫細(xì)胞的分化、成熟及功能，在獲得性免疫和先天免疫中均起重要作用[8]。近年來(lái)，GSK-3β已成為許多信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子，抑制GSK-3β的活性可以抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[9]，減少內(nèi)毒素血癥引起的器官損傷[10]。最近的研究表明抑制GSK-3β對(duì)RA的發(fā)展也有抑制作用[11-12]，然而目前抑制GSK-3β的抗炎作用機(jī)制尚不完全清楚，因此本研究觀察GSK-3β抑制劑對(duì)Ⅱ膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)小鼠的治療作用及其與DC亞群變化的相關(guān)性，旨在探討GSK-3β抑制劑治療CIA小鼠的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Specific Pathogen Free(SPF)級(jí)近交系DBA/l小鼠19只，雄性，6～8周齡，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證編號(hào)SCXK2017-0005)；SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飲食，環(huán)境溫度20±2 ℃，相對(duì)濕度30%～70%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始試驗(yàn)。

1.1.2主要試劑與儀器 雞Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑購(gòu)和多聚甲醛均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE) 試劑盒和RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液均購(gòu)自中國(guó)索萊寶有限公司，APC-cy7-CD3e、BV421-CD4、PerCP-Cy5.5-CD8a、PE-cy7-CD19、PE-CF594-CD11c及BB515-I-A/I-E購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司，GSK-3β抑制劑4-芐基-2甲基-1,2,4噻二唑烷-3,5-二酮(Thiadiazolidinones-8，TDZD-8)購(gòu)自上海阿拉丁公司；Navios流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Backman公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠CIA模型的建立、分組及臨床評(píng)價(jià) 19只DBA/l小鼠分為正常組5只、模型組7只及治療組7只，模型組與治療組小鼠均參照經(jīng)典的CIA模型方法制備CIA模型[13-16]，造模期間正常組小鼠無(wú)特殊處理，治療組小鼠于造模后第22天開(kāi)始每天腹腔注射5 mg/kg TDZD-8試劑[17]，模型組與正常組均予等量生理鹽水腹腔注射，連續(xù)注射2周；于腹腔注射藥物隔日開(kāi)始每3 d評(píng)估1次模型組與治療組小鼠足趾腫脹程度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分(arthritis index，AI)，未出現(xiàn)紅腫記0分、出現(xiàn)足趾關(guān)節(jié)紅腫記1分、趾關(guān)節(jié)和足跖均紅腫記2分、踝關(guān)節(jié)以下均出現(xiàn)紅腫記3分、包括踝關(guān)節(jié)全部出現(xiàn)紅腫記4分，每只爪子均評(píng)分，最高評(píng)分為16分[18-20]。第46天脫頸處死全部小鼠，取踝關(guān)節(jié)及脾臟做進(jìn)一步檢測(cè)。

1.2.2組織學(xué)觀察和GSK-3β表達(dá)檢測(cè) 取1.2.1項(xiàng)下小鼠右后肢踝關(guān)節(jié)，剔毛發(fā)及肌肉后浸泡于4%多聚甲醛溶液，固定3 d，放10%EDTA液，脫鈣1～2周，常規(guī)石蠟包埋、4 μm切片，HE染色，普通光鏡觀察；采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠踝關(guān)節(jié)處GSK-3β表達(dá)，顯微鏡下觀察，采用Image-Pro Plus測(cè)量各樣本的陽(yáng)性光密度值(integrated optical density，IOD)。

1.2.3脾臟淋巴組織駐留型DC(cDC)及CD8+cDC、CD4+CD8-cDC、CD4-CD8-cDC各亞群 取1.2.1項(xiàng)下小鼠脾臟，去包膜后切成0.2 cm×0.2 cm的脾片，置于含RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液的平皿中碾磨，200目網(wǎng)篩過(guò)濾獲細(xì)胞懸液；PBS沖洗收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min常溫離心10 min，棄上清；加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，避光孵育8 min，4 000 r/min離心5 min棄上清；將細(xì)胞調(diào)整為1×106mL(臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞數(shù)>95%)，分別加入APC-cy7-CD3e、BV421-CD4、PerCP-Cy5.5-CD8a、PE-cy7-CD19、PE-CF594-CD11c及BB515-I-A/I-E各1 μL混勻，4 ℃放置30 min ，PBS洗滌2次，PBS 0.5 mL重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，使用FlowJo 10軟件分析結(jié)果，參照文獻(xiàn)[20]方法排除T細(xì)胞CD3+和B細(xì)胞CD19+后，以CD11c+MHCⅡ+細(xì)胞占脾單細(xì)胞數(shù)量反映脾經(jīng)典DC(conventional DC，cDC)數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AI評(píng)分

與模型組相比，治療組小鼠AI評(píng)分在初次免疫后第33天開(kāi)始下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 GSK-3β抑制劑對(duì)小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響Tab.1 Effect of GSK-3β inhibitors on

2.2 小鼠體征

正常組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的精神和飲食水分活動(dòng)均正常，毛色光滑有光澤。 動(dòng)作自由，雙足無(wú)明顯紅腫，足趾墊無(wú)明顯腫脹和增厚，活動(dòng)基本正常； 與正常組小鼠比較，CIA模型組小鼠的進(jìn)食減少，伴隨著毛色失去光澤，有輕微的脫毛，行動(dòng)遲緩，足部關(guān)節(jié)發(fā)紅、出血及有潰瘍； 與模型組對(duì)比，治療組小鼠飲食、毛色光澤、脫毛以及關(guān)節(jié)處紅腫、出血點(diǎn)等現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠足趾腫脹情況Fig.1 Toe swelling of mice in each group

2.3 踝關(guān)節(jié)組織學(xué)觀察

HE染色病理切片鏡檢結(jié)果顯示，正常組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞單層排列，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及新生血管形成；模型組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞明顯增生，層次增多，排列紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，新生血管增生，滑膜下層纖維組織增生，血管翳形成，可見(jiàn)滑膜向軟骨表面侵蝕性生長(zhǎng)，破壞軟骨組織；治療組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織輕度增生，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)少許新生血管增生，無(wú)明顯軟骨及骨組織破壞。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠踝關(guān)節(jié)的組織學(xué)(HE，×100)Fig.2 Pathological changes of ankle joint tissues of mice in each group(HE，×100)

2.4 踝關(guān)節(jié)組織切片GSK-3β蛋白的表達(dá)

GSK-3β陽(yáng)性呈褐色或黃褐色，主要表達(dá)在小鼠的踝關(guān)節(jié)滑膜上皮和上皮下的疏松結(jié)締組織中；治療組小鼠踝關(guān)節(jié)GSK-3β蛋白表達(dá)低于模型組，高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：A為免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果(400×)，B為GSK-3β陽(yáng)性IOD值；(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。圖3 GSK-3β抑制劑對(duì)各組小鼠踝關(guān)節(jié)GSK-3β蛋白變化的影響Fig.3 Effect of GSK-3β inhibitor on the changes of GSK-3β protein in the ankle joint of mice

2.5 GSK-3β抑制劑對(duì)CIA小鼠脾臟總cDC細(xì)胞及其亞群的影響

模型組小鼠脾臟總cDC比例較正常組低，治療組較模型組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組小鼠脾臟CD4+cDC比例較正常組低，治療組較模型組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；正常組小鼠脾臟CD8+cDC與模型組、治療組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組小鼠脾臟CD4-CD8c-cDC較正常組高，治療組較模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：(1)與正常組相比，P<0.05；(2)與模型組相比，P<0.05。圖4 各組小鼠脾臟總cDC及各亞群比例的比較Fig.4 Ratio of total cDC and its subsets in spleen of each group

3 討論

CIA是一類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自身免疫性關(guān)節(jié)炎，是由天然Ⅱ型膠原蛋白與完全弗氏佐劑等量乳化后免疫易感動(dòng)物引起的[21-22]。由于其癥狀特征，病理變化和免疫指標(biāo)與人RA非常相似，因此被世界公認(rèn)為人RA動(dòng)物模型之一[23]。在該實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)向DBA/IJ小鼠尾根部皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑與雞Ⅱ型膠原的乳化液誘導(dǎo)CIA模型，模型組小鼠足趾在初次免疫后25 d出現(xiàn)紅腫，隨后病情進(jìn)一步加重，累及整個(gè)足趾及踝關(guān)節(jié)，在第1次免疫后33 d病情達(dá)到峰值；組織病理學(xué)觀察顯示，滑膜細(xì)胞明顯增生，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，新生血管增生，滑膜纖維組織增生，血管翳形成等典型的RA病理改變，表明該模型已成功建立。此結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[24-25]。隨后，通過(guò)該模型小鼠觀察了GSK-3β抑制劑TDZD-8對(duì)RA發(fā)病的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹腔注射TDZD-8能明顯緩解CIA小鼠踝關(guān)節(jié)紅腫，活動(dòng)受限等癥狀，降低關(guān)節(jié)病理?yè)p傷程度等，說(shuō)明GSK-3β抑制劑確實(shí)能緩解RA的關(guān)節(jié)病變。亦與近期研究報(bào)道相符[11-12]。

一般根據(jù)是否有β-catenin蛋白參與，將Wnt信號(hào)通路分成經(jīng)典信號(hào)通路和非經(jīng)典信號(hào)通路[26]。大多數(shù)關(guān)于Wnt 信號(hào)通路的研究都關(guān)注于β-catenin蛋白介導(dǎo)的經(jīng)典信號(hào)通路[27]。大量研究表明，Wnt信號(hào)可以通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的增殖和分化來(lái)促進(jìn)骨形成[28-31]。通過(guò)免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠滑膜GSK-3β蛋白含量較正常組升高，表明模型組小鼠中Wnt信號(hào)通路受到影響，被磷酸化標(biāo)記的β-catenin被泛素化降解，從而進(jìn)一步影響成骨細(xì)胞的分裂、分化及成熟；使用GSK-3β抑制劑后GSK-3β蛋白降低，表明模型組小鼠中GSK-3β抑制劑通過(guò)抑制GSK-3β蛋白的表達(dá)，從而使β-catenin去磷酸化，造成β-catenin 在細(xì)胞內(nèi)蓄積，從而介導(dǎo)下游靶基因的表達(dá)，保證成骨細(xì)胞的分裂、分化及成熟。

DC是一種包含眾多功能亞群的異質(zhì)性群體，常根據(jù)表型和功能的不同分為cDC和漿細(xì)胞樣DC(plasmacytoid DC,pDC)[32-33]，DC領(lǐng)域大部分研究工作都圍繞cDC展開(kāi)。在小鼠脾臟中cDC又可以分為CD8+cDC、CD4+CD8-cDC和CD4-CD8-cDC三個(gè)亞群。Balanescu等[34]檢測(cè)RA患者的關(guān)節(jié)滑膜組織和滑膜液時(shí)發(fā)現(xiàn)滑膜液中的DC數(shù)量增多，且高表達(dá)CD80、CD86及HLA-DR等共刺激分子，但在外周血中無(wú)明顯差異，說(shuō)明共刺激分子的表達(dá)及DC活化狀態(tài)與RA關(guān)節(jié)局部組織炎性浸潤(rùn)有關(guān)。Jongbloed等[35]進(jìn)一步證實(shí)了滑膜組織中DC數(shù)量的大量聚集。脾臟作為機(jī)體最大的外周免疫器官，是發(fā)揮免疫應(yīng)答效應(yīng)的重要場(chǎng)所[36]，其DC亞群及比例等是否存在變化目前相關(guān)報(bào)道甚少。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CIA小鼠脾臟中淋巴組織駐留型cDC明顯下降，而經(jīng)GSK-3β抑制劑治療后其比例又明顯上升，可能是由于脾臟中cDC遷移至滑膜關(guān)節(jié)組織，參加了炎癥反應(yīng)，GSK-3β抑制劑能抑制cDC遷移至滑膜關(guān)節(jié)組織，從而緩解RA炎癥反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)應(yīng)用GSK-3β抑制劑TDZD-8后，相較于模型組脾臟總cDC及CD4+cDC比例明顯升高，CD4-CD8-cDC比例明顯下降，CD8+cDC仍無(wú)明顯變化，這一結(jié)果表明GSK-3β抑制劑能治療RA的原因還可能是通過(guò)調(diào)節(jié)脾臟cDC各亞群的比例來(lái)發(fā)揮作用的。

綜述所述，GSK-3β抑制劑能明顯改善CIA小鼠關(guān)節(jié)病變情況其及病理表現(xiàn)，可能作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)脾臟cDC數(shù)量及各亞群的比例來(lái)實(shí)現(xiàn)。但本研究聚焦于小鼠脾臟中cDC各亞群的比例，而pDC亞型及滑膜處DC各亞群可能也不同程度的參與疾病進(jìn)展，有待進(jìn)一步的研究。