范友羊， 劉俊， 周海燕， 曾家順， 李龍*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腎病風(fēng)濕科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 貴州 貴陽 550004)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性自身免疫性疾病，主要以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要病理改變[1]。全球RA的發(fā)病率為0.5%～1%，我國大約為0.42%，目前RA患病的人數(shù)仍在增加[2]。研究RA最為常用的動物模型是膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)模型，其原因為CIA在臨床癥狀和病理表現(xiàn)方面與人RA非常相似[3]。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是體內(nèi)最強大的專職抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)，也是唯一能激活初始型T淋巴細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，在T細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫反應(yīng)中起重要的作用[4]。研究表明，DC的亞群和功能狀態(tài)可以直接影響初始T細(xì)胞分化為具有不同功能的抗原特異性T細(xì)胞的過程[4]。本研究擬通過建立CIA模型，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟淋巴組織駐留型經(jīng)典DC(conventional DC，cDC)及其各亞群的比例，分析這些指標(biāo)與CIA疾病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器

SPF級近交系DBA/l小鼠12只，雄性，6～8周齡，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證編號SCXK2017-0005。雞Ⅱ型膠原(chicken collagen type Ⅱ，CⅡ)和完全弗氏佐劑(Sigma公司)，APC-cy7標(biāo)記抗小鼠CD3e抗體、BV421標(biāo)記抗小鼠CD4抗體、PerCP-Cy5.5標(biāo)記抗小鼠CD8a 抗體、PE-cy7標(biāo)記抗小鼠CD19抗體、PE-CF594標(biāo)記抗小鼠CD11c抗體、BB515標(biāo)記抗小鼠 I-A/I-E抗體、組織脫水機、石蠟包埋機、手動切片機及光學(xué)顯微鏡(德國徠卡)，冷凍離心機(美國賽默飛世爾公司)。

1.2 方法

1．2．1分組及小鼠CIA模型的建立 將12只雄性DBA/l小鼠分為正常組(n=6)和模型組(n=6)，模型組小鼠參照經(jīng)典的CIA模型方法[5]，將CⅡ與弗氏完全佐劑1 ∶1等比例混合，置于冰浴，注射器反復(fù)抽吸、充分研磨至完全乳化，取完全乳化劑0.1 mL在小鼠尾根部多點皮內(nèi)注射。初次免疫后第21天，同劑量加強免疫1次。正常組小鼠注射同劑量0.9%氯化鈉溶液。

1．2．2CIA模型評估 從加強免疫后，開始每隔3 d記錄小鼠體重及足爪關(guān)節(jié)腫脹情況，共觀察3周。關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)評分衡量關(guān)節(jié)的病變情況，參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行評分。未出現(xiàn)紅腫記0分，出現(xiàn)足趾關(guān)節(jié)紅腫記1分，趾關(guān)節(jié)、足跖均紅腫記2分，踝關(guān)節(jié)以下均出現(xiàn)紅腫記3分，包括踝關(guān)節(jié)全部出現(xiàn)紅腫記4分；每只爪子均評分，最高評分為16分。第45天處死小鼠后切取右后肢踝關(guān)節(jié)，剔凈毛發(fā)及肌肉，將關(guān)節(jié)浸泡于4%多聚甲醛溶液中，固定3 d后放入10% EDTA 液中，脫鈣1～2周,常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，普通光鏡觀察小鼠踝關(guān)節(jié)情況。

1．2．3流式細(xì)胞儀檢測脾臟DC亞群及比例變化 第45天脫頸處死小鼠，打開腹腔取出小鼠脾臟，去包膜后切成0.2 cm×0.2 cm的脾片，置于含RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液的平皿中碾磨，200目網(wǎng)篩過濾獲得細(xì)胞懸液；PBS沖洗收集細(xì)胞懸液，常溫離心(1 000 r/min，10 min)；棄上清后加入紅細(xì)胞裂解液2 mL；避光孵育8 min，離心棄上清，將細(xì)胞調(diào)整為1×109L(臺盼藍(lán)染色活細(xì)胞數(shù)>95%)，分別加入APC-cy7標(biāo)記抗小鼠CD3e抗體、BV421標(biāo)記抗小鼠 CD4抗體、PerCP-Cy5.5標(biāo)記抗小鼠CD8a 抗體、PE-cy7標(biāo)記抗小鼠CD19抗體、PE-CF594標(biāo)記抗小鼠CD11c抗體和BB515標(biāo)記抗小鼠 I-A/I-E抗體，各1 μL，混勻，4 ℃放置 30 min ，PBS洗滌2次，PBS 0.5 mL重懸細(xì)胞，上機檢測，所測結(jié)果使用 FlowJo 10 軟件分析。參照文獻(xiàn)[7]排除T細(xì)胞CD3+和B細(xì)胞 CD19+后，以CD11c+MHCⅡ+細(xì)胞占脾單細(xì)胞數(shù)量反映cDC數(shù)量，分析CD8+cDC、CD4+CD8-cDC、CD4-CD8-DC各亞群比例的變化。

1．3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠關(guān)節(jié)情況及AI評分

造模期間，小鼠均未死亡。對照組小鼠精神飲食正常，行動自如，關(guān)節(jié)無紅腫；模型組部分小鼠從加強免疫第3天后開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫等表現(xiàn)，隨著時間的延長，模型組小鼠均出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)紅腫、行動遲緩等表現(xiàn)(圖1)。與對照組比較，模型組AI評分升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。HE染色顯示，對照組小鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整，未見炎性細(xì)胞浸潤及新生血管形成；模型組小鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)被破壞，關(guān)節(jié)軟骨可見明顯壞死脫落、纖維化，并有大量炎細(xì)胞浸潤，新生血管增生(圖3)。

對照組 模型組圖1 2組小鼠第45天后爪外觀Fig.1 Appearance of mouse hind paw between two groups on the 45th day

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖2 2組小鼠AI評分的比較Fig.2 Comparison of AI scores between two groups

對照組 模型組圖3 2組小鼠第45天踝關(guān)節(jié)組織HE染色(100×)Fig.3 HE staining of ankle joint tissue between two groups on the 45th day(100×)

2.2 脾源性cDCs細(xì)胞及各亞群比例比較

流式細(xì)胞數(shù)據(jù)表明，與對照組比較，模型組小鼠脾臟cDC及CD4+CD8-cDC比例降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型組小鼠CD8+cDC比例變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組CD4-CD8-cDC比例升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) 。見圖4。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖4 2組小鼠脾臟第45天cDCs細(xì)胞及亞群及比例變化Fig.4 Changes of subgroups and proportion of spleen cDCs cells between two groups on the 45th day

3 討論

RA是一種累及全身關(guān)節(jié)的自身免疫性疾病,其疾病的進(jìn)展由多種誘發(fā)因素和機體免疫異常造成。盡管目前關(guān)于RA的具體發(fā)病機制仍存在大量爭議，但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為 RA 是一種以Th1/Th17 免疫應(yīng)答為主的慢性炎性疾病。疾病的過程主要涉及APC對自身抗原的異常提呈。而DC是體內(nèi)功能最強的專職抗原提呈細(xì)胞，具有啟動和誘導(dǎo)初始型 T 細(xì)胞、促進(jìn)輔助性T細(xì)胞(Th)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的生成的作用[8]。DC起源于骨髓多能造血干細(xì)胞，在骨髓中形成，然后以非成熟狀態(tài)遷移到外周。根據(jù)其表型、組織分布和功能可分為不同的亞型。對于小鼠體內(nèi)的DCs亞型，常根據(jù)表型和功能的不同分為cDC和漿細(xì)胞樣DC(plasmacytoid DC,pDC)，這兩大類廣泛分布于外周血、淋巴組織和非淋巴組織中[9-11]。DC領(lǐng)域大部分研究工作都圍繞cDC展開。根據(jù)組織定位的不同又將cDC分為不同的亞型，cDC分為遷移型cDC(又稱非淋巴組織cDC)及淋巴組織駐留型cDC。在小鼠的脾臟中主要以淋巴組織駐留型cDC為主，其主要可以分為CD8+cDC和CD8-cDC兩個亞群，而CD8-cDC亞群又根據(jù)是否表達(dá)CD4+，將其分為CD4+CD8-cDC和CD4-CD8-cDC兩種類型。其中CD8+cDC約占脾臟cDC的20%～30%，主要分布在T細(xì)胞區(qū)，收集來自淋巴和血液轉(zhuǎn)移過來的抗原和病原體[12]。CD8+cDC與CD8-cDc亞型相比，CD8+cDC亞群主要通過MHC-I途徑提呈抗原，其能更有效的交叉提呈OVA模式抗原，活化CD8+T細(xì)胞[13]。同時CD8+cDC也能刺激TH1細(xì)胞產(chǎn)生極化細(xì)胞因子IL-12p70，而誘導(dǎo)CD4+Thl應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞因子就是IL-12p70，這表明CD8+cDC能直接刺激Thl型T細(xì)胞免疫應(yīng)答[14]。CD8-cDC主要分布于脾邊緣地帶，在脾臟cDC中含量最多，約占脾臟總DC的50%～60%，研究發(fā)現(xiàn)，在LPS或者TLR刺激下CD8-cDC會重新遷移到T細(xì)胞區(qū)從而刺激激活初始CD4+T細(xì)胞活化，產(chǎn)生炎性趨化因子，誘導(dǎo)TH2免疫應(yīng)答反應(yīng)[14]。CD8-cDC與CD8+cDC有些差異，CD8-cDC主要通過MHC-II類分子途徑將外源性抗原提呈給初始CD4+T細(xì)胞，其過程依賴于C-型凝集素受體如Dectin1等實現(xiàn)[15]。關(guān)于CD4+cDC和CD4-cDC兩個亞群的研究非常有限，有時甚至相互矛盾。Hochrein等[16]首次報道CD4-cDC在TLR刺激后能更有效的促進(jìn)IL-12的分泌，而另外2項研究表明，2組亞群的cDC在利什曼原蟲感染后其對IL-12的分泌影響無顯著差異[17-18]。Proietto等[19]也有報道稱CD4+cDC在TLR刺激后是炎性趨化因子的主要產(chǎn)生者。在穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激條件下研究CD4+cDC和CD4-cDC兩個亞群在OVA肽活化后對CD4+T淋巴細(xì)胞分化的影響，研究發(fā)現(xiàn)兩種亞群均能同樣啟動CD4+T淋巴細(xì)胞，并引起混合反應(yīng)。然而，值得注意的是CD4-cDC以分泌IL-12獨立的方式將反應(yīng)偏向Th1方向[18]。Emilie等[20]研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)態(tài)環(huán)境下，使用OVA肽激活DC和CD8-cDC兩個亞群在啟動CD4+和CD8T+淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力是一樣的，相反的是，當(dāng)用iNKT細(xì)胞激活劑a-GalCer激活時，CD4+cDC和CD4-cDC兩個亞群在體外和體內(nèi)激活和(或)分化iNKT細(xì)胞的能力明顯不同。本研究發(fā)現(xiàn)，在CIA小鼠脾臟中淋巴組織駐留型cDC明顯下降，其可能原因為脾臟中的cDC遷移至滑膜關(guān)節(jié)組織參加炎癥反應(yīng)，而其各亞群中CD8+cDC亞群無明顯差異，CD4-CD8-cDC亞群明顯升高，CD4+CD8-cDC亞群明顯降低，表明樹突狀細(xì)胞各亞群的變化與RA密切相關(guān)，其具體機制有待進(jìn)一步研究。