凌曉輝 陳佳鴻 陳志云 朱善文 劉利敏 陳光樂 柯潔榮

1 惠州市中心人民醫(yī)院生殖中心(惠州 516001) 2 惠州市中心人民醫(yī)院泌尿外科 (惠州 516001)

美國生殖醫(yī)學協(xié)會將復發(fā)性流產(chǎn)定義為連續(xù)兩次及以上流產(chǎn)。復發(fā)性流產(chǎn)目前已知的原因包括遺傳因素，子宮解剖學因素，內(nèi)分泌因素，免疫功能失調(diào)及易栓癥[1]。但是50%夫婦原因不明確。過去，復發(fā)性流產(chǎn)夫婦主要是女方進行一系列的醫(yī)學檢查，而男方僅僅進行染色體篩查。研究表明染色體正常男性的精子仍存在非整倍體，男性配子提供50%受精需要的遺傳物質(zhì)[2]，所以基因異常或表觀遺傳學異常的精子仍可能同卵子受精。然而這種情況導致染色體損傷，而影響胚胎的早期發(fā)育。

許多研究證實精子DNA損傷同不育的發(fā)生、人工授精受孕率的降低及IVF/ICSI優(yōu)質(zhì)卵裂胚及囊胚形成概率的降低均密切相關(guān)[3]。精子DNA碎片率的檢測能更好的評估男性生育力，有利于改善輔助生殖技術(shù)的成功率[4]。研究發(fā)現(xiàn)無癥狀的男性生殖道感染是男性不育的主要因素，12%～35%的男性伴侶感染引起不育[5-6]。精漿彈性蛋白酶指標增高是男性生殖道感染的指標[7]，但是彈性蛋白酶是否同復發(fā)性流產(chǎn)男性患者的精液參數(shù)與DNA碎片率相關(guān)亟待研究。

1 資料與方法

1.1 基本情況

回顧性分析2019年6月—2020年1月的惠州市中心人民醫(yī)院生殖中心的復發(fā)性流產(chǎn)夫婦。復發(fā)性流產(chǎn)病例中，60例夫婦流產(chǎn)2次，16例夫婦流產(chǎn)3次，4例夫婦流產(chǎn)大于3次。夫妻雙方均染色體核型正常。排除標準為女方年齡大于40歲、內(nèi)分泌異常，子宮結(jié)構(gòu)性畸形、抗磷脂抗體綜合征及凝血障礙等；男方近三個月經(jīng)歷泌尿生殖道感染、發(fā)熱病史、慢性系統(tǒng)性疾病、過量飲酒、高溫環(huán)境、輻射暴露及抗氧化治療等。另外，選擇25例夫婦2019年1月—2020年1月在我科因女方輸卵管因素行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)，其余排除標準同復發(fā)性流產(chǎn)病例，女方均行IVF-ET后生育后代或懷孕至三個月以上，這些男性患者作為彈性蛋白酶比較的對照組。我們將復發(fā)性流產(chǎn)男性患者按彈性蛋白酶的參考值分為兩個組別：正常組(<600 ng/mL)及異常組(≥600 ng/mL)。本項研究惠州市中心人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 精液分析

禁欲2～7天采集精液標本，精液液化后，稱重法計算體積，計算機輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)檢測精液的量、pH值、活力、濃度及前向運動比例，前向運動精子總數(shù)(TMSC)=精液量×濃度×前向運動比例。精子形態(tài)學分析嚴格按照WHO第五版《人類精液檢查及處理實驗室手冊》執(zhí)行。高倍顯微鏡分析精子的頂體、頭、頸、中段及尾。精液標本經(jīng)涂片、染色后，×100顯微鏡下觀察并計數(shù)精子形態(tài)。

1.3 精漿彈性蛋白酶的檢測

試劑盒由深圳博銳德生物科技有限公司提供。留取精漿10 μL，加入標本稀釋液500 μL，混勻，同時制備校準品。將5個標準品及精漿樣品加入包被微孔，膠膜封板并孵育，洗板。每孔加入酶結(jié)合物100 μL，孵育后洗板。每孔先后加入顯色液及終止液后，15 min內(nèi)450/630 nm比色，并標準曲線擬合。試劑盒推薦的正常參考值標準為<600 ng/mL。

1.4 精子染色質(zhì)擴散試驗(SCD)

精子DNA的完整性采用精子染色質(zhì)擴散實驗檢測，試劑盒由深圳博銳德生物科技有限公司提供。運用普通顯微鏡(400×)鏡頭，選取并觀察500個染色精子，計數(shù)存在DNA碎片的精子數(shù)量。精子DNA碎片的判斷標準如下：精子頭部僅產(chǎn)生較小的光暈或無光暈，單側(cè)光暈的厚度不超過精子頭部最小直徑的1/3。精子DNA碎片化率(%)=存在DNA碎片精子數(shù)÷被觀察精子總數(shù)×100%。試劑盒推薦的正常參考值為精子DNA碎片率<25%。

1.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件，連續(xù)性變量運用均數(shù)±標準差表示，復發(fā)性流產(chǎn)及對照組數(shù)據(jù)的比較采用兩獨立樣本的t檢驗或秩和檢驗。Spearman相關(guān)分析探討精漿彈性蛋白酶同精子活力、正常形態(tài)百分率及精子DNA碎片率的關(guān)系。所有指標均雙側(cè)檢測(two-sided test)，P<0.05被認為是差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

首先檢測80例復發(fā)性流產(chǎn)男性患者及20例正常生育男性的精漿彈性蛋白酶水平，我們發(fā)現(xiàn)同對照組相比，復發(fā)性流產(chǎn)男性患者的彈性蛋白酶是增高的(102.32±54.07 vs 605.98±864.72，t=6.53，P=0.010)。

其次，我們對復發(fā)性流產(chǎn)男性患者的不同精漿彈性蛋白酶水平下，男方年齡、精液量、pH值、精子活力、濃度、總數(shù)、精子形態(tài)及DNA碎片率進行差異比較(表1)。按照精漿彈性蛋白酶的參考值，將復發(fā)性流產(chǎn)男性分為正常組(<600 ng/mL)及異常組(≥600 ng/mL)。我們結(jié)果顯示，兩組的年齡(t=1.58，P=0.119)、精液量(t=-0.62，P=0.538)、pH值(t=1.24，P=0.685)、精子濃度(t=0.06，P=0.953)及總數(shù)(t=-0.39，P=0.697)均無差異；同彈性蛋白酶正常組患者相比，異常組患者的精子前向運動比例(t=3.52，P=0.002)及正常形態(tài)百分率(t=-2.66，P=0.009)均降低，而精子DNA碎片率(t=3.51，P=0.001)增高。

表1 復發(fā)性流產(chǎn)患者不同彈性蛋白酶水平的相關(guān)參數(shù)比較

最后，Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)精漿彈性蛋白酶同精子前向運動比例(r=-0.43，P<0.001；圖1A)及正常形態(tài)百分率(r=-0.39，P<0.001；圖1B)負相關(guān)，而同精子DNA碎片率(r=0.36，P=0.001；圖1C)正相關(guān)。

圖1 精漿彈性蛋白酶同精子參數(shù)的相關(guān)性分析

3 討 論

生殖道感染期間，激活的粒細胞分泌彈性蛋白酶和染色質(zhì)，其壞死或凋亡后會形成胞外殺菌網(wǎng)絡，繼續(xù)殺滅細菌。精液白細胞及精漿彈性蛋白酶指標是判斷男性生殖道感染的重要指標[8]。粒細胞是活性氧產(chǎn)生的機器，能夠破壞精子DNA及細胞膜，從而影響精子參數(shù)。男性不育患者發(fā)生彈性蛋白酶升高的可能性更高[9]，研究也發(fā)現(xiàn)彈性蛋白酶增高影響卵裂胚向囊胚的進展，說明生殖道感染同生育潛能密切相關(guān)[10]。

精子DNA完整性在胚胎發(fā)育及胎兒健康方面發(fā)揮著重要作用且DNA碎片率也作為評估復發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)鍵指標[11]。目前常用于檢測精子DNA碎片率的方法包括精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法(SCSA)、末端轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP末端標記法(TUNEL)及精子染色質(zhì)擴散法(SCD)。精子異常同凋亡密切相關(guān)，機制可能跟睪丸精子發(fā)生過程中細胞核重塑錯誤有關(guān)[12]。精子凋亡可見于精子冷凍及毒素暴露的環(huán)境。并且，生殖道感染的男性，其凋亡靶標基因的表達也是異常的。實驗表明，彈性蛋白酶抑制劑增加細胞的生存可能，并且其能夠恢復細胞的活力[13]?；钚匝?ROS)能夠誘導細胞質(zhì)膜的對稱性，白細胞及活性氧的增加同基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)表達的降低及DNA碎片的增加密切相關(guān)[7]。

雖然許多研究發(fā)現(xiàn)復發(fā)性流產(chǎn)同精子DNA碎片率顯著正相關(guān)，其影響機制尚不明朗。精子DNA完整性是遺傳物質(zhì)能夠正確傳遞給后代的必需條件，DNA損傷能夠增加流產(chǎn)的概率。一些研究發(fā)現(xiàn)DNA碎片率隨著年齡的增長而升高。DNA碎片的產(chǎn)生主要是外部因素引起，包括氧化應激，而不是細胞程序化死亡[14]。目前治療也是抗氧化治療為主，研究發(fā)現(xiàn)口服抗氧化藥物治療能夠降低精子DNA碎片率[14]。DNA鏈斷裂常發(fā)生在減數(shù)分裂的過程，氧化應激能夠誘導DNA退化而導致單鏈和雙鏈斷裂；DNA損傷的精子能夠同卵子結(jié)合并受精，而父系基因的激活影響早期胚胎的發(fā)育[15]。

為了探討泌尿生殖道感染同男性不育的關(guān)系，有研究發(fā)現(xiàn)：當精液白細胞及精漿彈性蛋白酶稍增加時，男性不育患者精子壞死及DNA變性的概念明顯增加[7]。Kopa等研究納入340例男性不育患者的精液樣本，發(fā)現(xiàn)101例患者(29.7%)彈性蛋白酶濃度為250～1 000 ng/mL,21例患者(6.2%)的彈性蛋白酶濃度大于1 000 ng/mL[7]。并且國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)彈性蛋白酶同男性不育患者的精子前向運動比例、正常形態(tài)百分率及DNA完整性顯著負相關(guān)[16-17]。復發(fā)性流產(chǎn)男性患者的精漿彈性蛋白酶同精子參數(shù)的關(guān)系，未見相關(guān)報道。我們研究也表明復發(fā)性流產(chǎn)男性患者精漿彈性蛋白酶的增高同精子活力及正常形態(tài)精子百分率負相關(guān)，而同精子DNA碎片率是正相關(guān)的。這說明復發(fā)性流產(chǎn)男性患者的生殖道感染同精子參數(shù)是密切聯(lián)系的。

總之，由于炎癥影響精液質(zhì)量的事實經(jīng)常被忽略，復發(fā)性流產(chǎn)男性患者的生殖道隱性感染值得重視，其相關(guān)臨床探討性值得深入研究。