楊靖，王瓊波，費(fèi)嘉祥，楊鵬飛，劉宛凌,李天笑，白冰，毛多斌

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002；2.漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 食品營養(yǎng)系，河南 漯河 462002；3.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司許昌卷煙廠，河南 許昌 461000)

作為一類天然安全的抑菌劑和抗氧化劑，植物提取物在日常的食品保鮮中具有非常廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。木槿(HibiscussyriacusL.)，為錦葵科木槿屬植物，是一種傳統(tǒng)的中草藥，其花、葉、皮均可入藥，在中國和韓國已有數(shù)百年的使用歷史[4]，目前，國內(nèi)外對木槿的研究主要集中在花和葉上。金月亭等[5]發(fā)現(xiàn)木槿花提取物具有良好的清除自由基、抗氧化能力和抑菌能力。黃采姣等[6]研究發(fā)現(xiàn)木槿花的抗氧化活性與其多酚和總黃酮含量間有極顯著的相關(guān)性，并從木槿花正丁醇萃取物中初步鑒定出8種抗氧化物質(zhì)。耿明江等[7]、張婕等[8]采用乙醇對木槿花醇溶性色素進(jìn)行提取并研究其清除超氧自由基的活性。楊少宗等[9]發(fā)現(xiàn)來自浙江蒼南和龍泉的紫花重瓣木槿營養(yǎng)價值較高，具有較高的開發(fā)利用價值。楊濤等[10]對木槿葉中總酚的提取工藝及抗氧化作用進(jìn)行了研究。陳磊等[11]對木槿葉總黃酮提取工藝及其抗氧化活性進(jìn)行了研究。Punasiya等[12-14]研究發(fā)現(xiàn)木槿葉不同溶劑提取物的抗氧化效力與抗壞血酸非常接近，其中甲醇提取物中的類黃酮含量最高，具有較強(qiáng)的抗菌活性，對蠟狀芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和枯草芽孢桿菌具有明顯的抑制作用。Jang等[15]發(fā)現(xiàn)木槿皮的熱水和70%乙醇提取物對革蘭氏陰性細(xì)菌和大腸桿菌均有抑制作用，其抑制性與提取物濃度成正比。Kwon等[16]指出木槿根皮提取物具有抗氧化性，且木槿根皮提取物熱處理后清除自由基的活性顯著增加。但木槿皮的揮發(fā)性化學(xué)成分及抑菌性的研究卻鮮有報(bào)道。本文以無水乙醇為溶劑采用超聲波輔助提取技術(shù)對木槿皮進(jìn)行提取[17，18]，采用GC×GC-Q-TOFMS分析提取物的化學(xué)成分，并對其抑菌性進(jìn)行研究，為木槿皮的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木槿皮：市售，北京同仁堂；大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌、高地芽孢桿菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯氏菌：以上菌種均由鄭州輕工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

7200/7890B GC×GC-Q-TOFMS 美國安捷倫科技公司；SSM01固態(tài)調(diào)制器 上海雪景科技有限公司；KQ2200B型超聲波提取裝置 昆山市超聲儀器有限公司；LA-230S型電子天平(感量0.001 g) 北京賽多利斯儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 木槿皮的提取

將干燥的木槿皮粉碎稱重，放入500 mL三角瓶中，加入適量的無水乙醇，置于超聲波提取裝置中，選擇在不同的液料比、粉碎度、提取溫度、提取時間下萃取，萃取完成后取出三角瓶，抽濾，濾液在低溫條件下旋蒸除去乙醇獲得木槿皮提取物。

1.3.2 分析條件

1.3.2.1 GC×GC-TOFMS色譜條件

柱1：HP-5MS(Agilent Scientific，60 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱2：DB-17(Agilent Scientific，1.2 m×0.18 mm×0.25 μm)，兩根色譜柱以串聯(lián)方式連接，調(diào)制周期4 s。進(jìn)樣口溫度280 ℃，載氣He，載氣流速1.5 mL/min。程序升溫條件：起始溫度50 ℃，保留5 min，以4 ℃/min升溫到270 ℃，保留3 min，進(jìn)樣量1 μL，分流比100∶1，掃描頻率50 Hz，掃描離子范圍(m/z)：50～500 u。

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

四級桿溫度：150 ℃；離子源溫度(EI)：280 ℃；檢測器電壓：1700 V；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：230 ℃。

1.3.2.3 揮發(fā)性物質(zhì)的定性分析

全二維數(shù)據(jù)處理采用Canvas公司的軟件(Version 2.0)，自動識別信噪比大于30的峰，采用NIST 02質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫鑒定各色譜峰的化學(xué)成分，采用面積歸一化法測定各成分的相對含量。

1.3.3 抑菌性試驗(yàn)

稱取25 g肉湯培養(yǎng)基、18 g瓊脂，加入1000 mL蒸餾水，加熱溶解后分裝，于121 ℃高壓滅菌15 min，備用。用于大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌等的培養(yǎng)和抑菌試驗(yàn)。

采用倍比稀釋法在96孔板中測定最小抑菌濃度(MIC)[19]。在MIC測定試驗(yàn)中，從無菌生長的液體培養(yǎng)基中取出20 mL涂布平板，繼續(xù)培養(yǎng)(37 ℃/24 h)，觀察有無菌落生長。無菌落生長的最小濃度即為最小殺菌濃度(MBC)。MIC試驗(yàn)中，為了保證提取物與培養(yǎng)液的互溶性，需在培養(yǎng)液中加入1%(V/V)的吐溫80做乳化劑。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 液料比對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取40目的木槿皮粉末10 g，分別按照液料比5∶1、8∶1、10∶1、12∶1、15∶1的比例加入無水乙醇，在25 ℃的條件下超聲萃取15 min，木槿皮的提取率見圖1。

圖1 液料比對產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of ratio of liquid to solid on yield of Hibiscus syriacus L.

由圖1可知，木槿皮提取率隨液體比例增大而提高，當(dāng)液料比為12∶1時，木槿皮提取率最高，繼續(xù)增加溶劑的量，提取效率略有降低，可能是因?yàn)槿軇┻^量會造成超聲作用不完全，不能將所有的細(xì)胞壁震破，而導(dǎo)致提取率偏低。

2.2 粉碎度對提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱取20，40，60，80，100目木槿皮粉末10 g，按照液料比10∶1加入無水乙醇，在25 ℃的條件下超聲萃取15 min，木槿皮的提取率見圖2。

圖2 粉碎度對產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of crushing particle size on yield of Hibiscus syriacus L.

由圖2可知，木槿皮的提取率隨著粉碎度的增加呈上升趨勢，這主要是由于粉碎度越大，萃取溶劑的接觸面就越大，木槿皮中的有效成分就越容易被提取出來。

2.3 時間對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取40目的木槿皮粉末10 g，按照液料比10∶1加入無水乙醇，在25 ℃的條件下分別超聲萃取10，15，20，25，30 min，木槿皮的提取率見圖3。

圖3 時間對產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of time on yield of Hibiscus syriacus L.

由圖3可知，木槿皮的提取率隨著時間的延長呈上升趨勢，當(dāng)超聲時間超過25 min后，木槿皮的提取率隨超聲時間的繼續(xù)延長增加很少，這主要是由于木槿皮中的有效成分在25 min時基本都被提取出來。

2.4 溫度對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取40目的木槿皮粉末10 g，按照液料比10∶1加入無水乙醇，分別在20，25，30，35，40 ℃的條件下超聲萃取15 min，木槿皮的提取率見圖4。

圖4 溫度對產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of temperature on yield of Hibiscus syriacus L.

由圖4可知，木槿皮的提取率隨著溫度的升高呈增加趨勢，當(dāng)超聲溫度超過35 ℃后，木槿皮的提取率隨溫度的升高反而降低，這可能是由于萃取溫度逐漸上升，木槿皮中的一些低沸點(diǎn)成分易揮發(fā)，所以提取率略有下降。

2.5 正交試驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，對影響超聲波萃取的主要因素進(jìn)行了四因素四水平試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 試驗(yàn)因素及水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The orthogonal experimental results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

由表2可知，影響因素大小順序?yàn)椋耗繑?shù)>提取時間>液料比>提取溫度，最佳提取條件為：粉碎度100目，提取時間30 min，液料比15，提取溫度40 ℃。

由表3可知，目數(shù)和提取時間為極顯著影響因子，液料比為顯著影響因子，提取溫度為不顯著影響因子。

2.6 揮發(fā)性成分分析

木槿皮提取物采用GC×GC-Q-TOFMS分析，所得全二維色譜圖見圖5，以計(jì)算機(jī)檢索譜庫確定化合物，以質(zhì)譜離子峰面積百分?jǐn)?shù)表示各成分含量，分析結(jié)果見表4。

圖5 木槿皮提取物全二維色譜圖Fig.5 The comprehensive two-dimensional chromatogram of Hibiscus syriacus L. extracts

表4 木槿皮提取物化學(xué)成分分析結(jié)果Table 4 The analysis results of chemical components of Hibiscus syriacus L. extracts

續(xù) 表

木槿皮提取物中共鑒定出41種揮發(fā)性成分，占總萃取物的63.78%，其中：酯類12種，酸類7種，烷烴類7種，醇類4種，酮類4種，酚類3種，醚類2種，醛類2種。含量較高的成分是一些酯類和酸類，如：己二酸-(2-乙基己基)酯(21.35%)、亞油酸(6.25%)、油酸(5.70%)和14-甲基十六酸異丙酯(3.67%)。

2.7 抑菌性試驗(yàn)結(jié)果

木槿皮提取物以及青霉素鈉對7種不同細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)以及最小殺菌濃度(MBC)測定結(jié)果見表5和表6。

表5 木槿皮提取物的最小抑菌濃度(MIC)Table 5 The minimum inhibitory concentration (MIC) of Hibiscus syriacus L. extracts μg/mL

表6 木槿皮提取物的最小殺菌濃度(MBC)Table 6 The minimum bactericidal concentration (MBC) of Hibiscus syriacus L. extracts μg/mL

由表5和表6可知，木槿皮提取物對7種細(xì)菌都具有一定的抑菌和殺菌能力，其中對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和高地芽孢桿菌的抑菌效果較好，對糞腸球菌和地衣芽孢桿菌的抑菌能力相對較差；木槿皮提取物對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和高地芽孢桿菌的殺菌效果相對較好，最小殺菌濃度(MBC)為500 μg/mL，對其他4種細(xì)菌的殺菌效果相對較差，最小殺菌濃度為1000 μg/mL。主要原因是木槿皮中含有的一些類黃酮、三萜類化合物和糖苷類化合物已被證實(shí)具有抗菌性，這些化合物易于被乙醇萃取出來，同時木槿皮提取物中含有的異丁香酚(0.19%)、丹皮酚(0.11%)和肉豆蔻醚(0.03%)也具有一定的抑菌作用。

3 討論

揮發(fā)油是植物中重要的次級代謝產(chǎn)物，本研究從木槿皮提取物中共鑒定出41種揮發(fā)性成分，占總萃取物的63.78%，含量較高的成分是一些酯類和酸類如：己二酸-(2-乙基己基)酯(21.35%)、亞油酸(6.25%)、油酸(5.70%)和14-甲基十六酸異丙酯(3.67%)。同一植物不同部位提取物的抑菌性存在一定的差異。金月亭采用40%的乙醇浸提木槿花，發(fā)現(xiàn)提取液質(zhì)量濃度為100 mg干花/mL時，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用較為明顯，質(zhì)量濃度為125 mg干花/mL時，對枯草桿菌有一定的抑制作用，質(zhì)量濃度為150 mg干花/mL時，對曲霉的抑制作用不太明顯，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)木槿花提取液對大腸桿菌、枯草桿菌、曲霉、金黃色葡萄球菌4種菌種未能完全抑制。Punasiya采用水、甲醇、石油醚、苯、氯仿對木槿葉進(jìn)行了萃取，并研究每種萃取物對蠟狀芽孢桿菌(MTCC-430)、表皮葡萄球菌(MTCC-435)、肺炎克雷伯氏菌(MTCC-432)和枯草芽孢桿菌(MTCC-121)的抗菌性。結(jié)果顯示每種提取物都有一定的抗菌活性，但不同提取物的抗菌活性之間存在差異，甲醇提取物對4種細(xì)菌具有最好的抑制活性，其對蠟狀芽孢桿菌(MTCC-430)、表皮葡萄球菌(MTCC-435)、肺炎克雷伯氏菌(MTCC-432)和枯草芽孢桿菌(MTCC-121)的最小抑菌濃度(MIC)分別為312，156，312，78 μg/mL。本研究發(fā)現(xiàn)木槿皮的乙醇提取物也具有較好的抗菌活性，其對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、地衣芽孢桿菌和高地芽孢桿菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為306，470，544，246，271，654，276 μg/mL，對比發(fā)現(xiàn)：木槿花提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用較好，木槿葉提取物對枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的抑制作用較好，木槿皮提取物對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和高地芽孢桿菌的抑菌性較好；木槿皮提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果好于木槿花提取物，對肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果要好于木槿葉提取物，但對枯草芽孢桿菌的抑菌性要弱于木槿葉提取物。主要原因是植物的化學(xué)成分在不同的生長部位存在組成和含量的差異，而其抑菌性是多種成分共同作用的結(jié)果。

4 結(jié)論

木槿具有藥用、食用、觀賞兼?zhèn)涞膬r值，是一種很有開發(fā)前景的綠色經(jīng)濟(jì)植物，目前國內(nèi)外對木槿的花和葉進(jìn)行了大量的研究。本文以無水乙醇為溶劑，對木槿皮進(jìn)行了超聲波萃取，通過GC×GC-Q-TOFMS對提取物的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，共鑒定出41種揮發(fā)性成分，主要成分為己二酸-(2-乙基己基)酯(21.35%)、亞油酸(6.25%)、油酸(5.70%)和14-甲基十六酸異丙酯(3.67%)；提取物對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌、高地芽孢桿菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯氏菌均有一定的抑制作用，本研究為木槿皮作為一種天然食品抑菌劑的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。