孫天穎，程紅，張明站，任健*

(1.齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米主食工業(yè)化工程技術(shù)研究中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

近年來，超聲技術(shù)在食品的提取、干燥、滅菌、清洗等方面已得到深入研究[1]。近年來，由于超聲波無污染且作用過程中無化學(xué)添加的優(yōu)勢，涌現(xiàn)出大批采用超聲波輔助水解蛋白的相關(guān)研究，且生物活性肽的發(fā)展也是當(dāng)下的熱門話題。有研究表明，用超聲波進(jìn)行預(yù)處理后，能夠使底物蛋白的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，同時(shí)能加快酶和底物蛋白兩者之間的能量以及物質(zhì)傳遞，以提高蛋白酶解作用[2-4]。超聲波輔助水解的原理主要是機(jī)械效應(yīng)和活化效應(yīng)。蛋白會(huì)受到超聲波在介質(zhì)中傳播中瞬間產(chǎn)生出來的高強(qiáng)度剪切力，能夠促使蛋白構(gòu)象被改變甚至被降解，以這種方式來提高蛋白溶解度和酶解速度的方法稱為機(jī)械效應(yīng)。而活化效應(yīng)更偏向于超聲波傳播時(shí)會(huì)產(chǎn)生高溫、高壓的空化現(xiàn)象，空化現(xiàn)象發(fā)生時(shí)，體系內(nèi)的大分子化學(xué)鍵發(fā)生斷裂從而被分解成小分子，以提高蛋白的水解作用[5,6]。

本文旨在研究超聲波底物預(yù)處理對玉米胚芽粕酶解的影響，以水解度、水解物中可溶性蛋白含量及抗氧化活性為指標(biāo)，優(yōu)化超聲波預(yù)處理玉米胚芽粕條件，提高酶解效率，也為玉米胚芽粕生物活性肽的資源化利用和相關(guān)產(chǎn)品發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

玉米胚芽脫脂粕：蛋白含量24.15%，自制；Alcalase堿性蛋白酶：無錫杰能生物工程公司；Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶：丹麥Novo Nordisk公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、Tris等其他試劑均為分析純。

1.2 主要設(shè)備儀器

智能超聲波清洗器(型號(hào)DL-360E) 上海之信儀器有限公司；凱氏定氮儀(型號(hào)B324) 日立公司；紫外可見分光光度計(jì)(型號(hào)DU800) 貝克曼公司；pH計(jì)(型號(hào)PB-10) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋(型號(hào)HH.S21-1)、水浴恒溫振蕩器(型號(hào)SHZ-88) 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水解指標(biāo)的測定

水解度的測定采用pH滴定法，可溶性蛋白含量的測定采用Folin-酚法，抗氧化活性的測定采用改進(jìn)的鄰苯三酚自氧化法——微量進(jìn)樣法[7]。

1.3.2 超聲波預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化

超聲波功率、超聲波時(shí)間、超聲波溫度是影響超聲波預(yù)處理的三大因素。依次采用堿性蛋白酶(水解溫度45 ℃，pH值10.5，反應(yīng)時(shí)間180 min，加酶量5%(W/W))和風(fēng)味蛋白酶(水解溫度50 ℃，pH值6.2，反應(yīng)時(shí)間240 min，加酶量3%(W/W))對玉米胚芽脫脂粕進(jìn)行水解，每相隔一段時(shí)間提取一定量的酶解液，一部分立刻在100 ℃下加熱20 min鈍化酶活力，另一部分立即測定其水解度(pH滴定法)，4000 r/min下離心被鈍化后的樣品20 min，提取上清液，用以檢測樣品溶液中可溶性蛋白含量和抗氧化活性。以抗氧化活性為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)(超聲溫度、超聲功率和超聲時(shí)間)，確定玉米胚芽脫脂粕酶解時(shí)最佳超聲波預(yù)處理的條件。

1.3.3 超聲波預(yù)處理酶解效果的比較

采取最佳雙酶水解組合方式水解玉米胚芽脫脂粕，在此期間用超聲波替代磁力攪拌器進(jìn)行反應(yīng)，測定間隔一定時(shí)間后樣品的水解度、可溶性蛋白含量及抗氧化活性，通過上述指標(biāo)選取最優(yōu)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲功率對水解效果的影響

本試驗(yàn)的超聲功率選取360 W×(20%、40%、60%、80%、99%)作用于樣品30 min，每組做3個(gè)平行，考察超聲波功率對酶解效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖1～圖3。

圖1 超聲功率對水解度的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on hydrolysis degree

圖2 超聲功率對可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on soluble protein content

圖3 超聲功率對水解物抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on antioxidant activity of hydrolysate

由圖1～圖3可知，超聲波預(yù)處理中超聲功率顯著影響玉米胚芽粕的酶解作用。水解度、可溶性蛋白含量和抗氧化活性于雙酶相比，在較低功率時(shí)略有增加。玉米胚芽粕酶解時(shí)間在0～7 h期間，360 W×40%的超聲功率下酶解物的水解度、可溶性蛋白含量和抗氧化活性均高于其他超聲功率，超聲功率大于360 W×40%時(shí)，酶解物的水解度和可溶性蛋白含量逐步遞減。原因是在溶液介質(zhì)中低功率超聲波作用有利于底物和酶的結(jié)合，過大的功率會(huì)產(chǎn)生空化作用，破壞其原材料，促使高功率超聲作用下酶解物的抗氧化活性下降并且降低酶解效果，導(dǎo)致水解物的各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果較低。綜合考慮，最佳超聲功率應(yīng)為360 W×40%。

2.2 超聲時(shí)間對水解效果的影響

本試驗(yàn)選擇不同超聲時(shí)間(10，20，30，40，50 min)，用超聲波對玉米胚芽粕進(jìn)行輔助酶解，反應(yīng)結(jié)束后提取這5種不同酶解液的上清液檢測其水解度、可溶性蛋白含量以及抗氧化活性，每組做3個(gè)平行，試驗(yàn)結(jié)果見圖4～圖6。

圖4 超聲時(shí)間對水解度的影響 Fig.4 Effect of ultrasonic time on hydrolysis degree

圖5 超聲時(shí)間對可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on soluble protein content

圖6 超聲時(shí)間對水解物抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on antioxidant activity of hydrolysate

由圖4～圖6可知，反應(yīng)時(shí)間由0 h增長到7 h時(shí)，30 min超聲時(shí)間作用的玉米胚芽粕酶解液的水解度和可溶性蛋白含量均高于其他超聲時(shí)間作用下的酶解液，雖然在1～3 h之間，30 min超聲時(shí)間作用的酶解液的抗氧化活性較低，但整體作用效果均高于其他超聲時(shí)間。超聲處理玉米胚芽粕在30 min超聲時(shí)間之前，還未來得及進(jìn)行反應(yīng)，只是促使體系變得更加均勻，在30 min時(shí)，玉米胚芽粕與酶充分結(jié)合反應(yīng)達(dá)到最佳，當(dāng)超聲時(shí)間超過30 min以后，水解反應(yīng)達(dá)到最大，此時(shí)水解趨勢不再變化甚至有下降趨勢。總之，選擇30 min為最優(yōu)的超聲時(shí)間。

2.3 超聲溫度對水解效果的影響

本試驗(yàn)選擇不同超聲溫度(20，30，40，50，60 ℃)，用超聲波對玉米胚芽粕進(jìn)行輔助酶解，反應(yīng)結(jié)束后提取這5種不同酶解液的上清液檢測其水解度、可溶性蛋白含量以及抗氧化活性，每組做3個(gè)平行，試驗(yàn)結(jié)果見圖7～圖9。

圖7 超聲溫度對水解度的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on hydrolysis degree

圖8 超聲溫度對可溶性蛋白含量的影響 Fig.8 Effect of ultrasonic temperature on soluble protein content

圖9 超聲溫度對水解物抗氧化活性的影響Fig.9 Effect of ultrasonic temperature on antioxidant activity of hydrolysate

由圖7～圖9可知，反應(yīng)時(shí)間由0 h增長到7 h時(shí)，50 ℃超聲溫度作用的玉米胚芽粕酶解液的水解度、可溶性蛋白含量和抗氧化活性均高于其他超聲溫度作用下的酶解液。超聲波本身是一種能夠散發(fā)熱量的能量形式，超聲處理玉米胚芽粕在超聲溫度50 ℃以下時(shí)，超聲波主要是以散發(fā)熱量為主要形式，在這種環(huán)境下玉米胚芽粕能夠吸收能量，以此來提高水解反應(yīng)速率[8]，此時(shí)這種加熱作用在50 ℃時(shí)，玉米胚芽粕與酶充分結(jié)合反應(yīng)達(dá)到最佳，當(dāng)超聲溫度超過50 ℃以后，會(huì)引起空化作用，導(dǎo)致部分底物被破壞，水解反應(yīng)受到抑制。綜上所述，選擇50 ℃為最優(yōu)的超聲溫度。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采取三因素三水平試驗(yàn)表L9(33)，3個(gè)因素分別為超聲功率(A)、超聲時(shí)間(B)和超聲溫度(C)，L9(33)正交試驗(yàn)因素水平表見表1，本試驗(yàn)采取的指標(biāo)為抗氧化活性，確定最終最優(yōu)條件的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 L9(33)正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(33) orthogonal test

表2 L9(33)正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Design and result of orthogonal test L9(33)

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The result of variance analysis

由表2可知，超聲波輔助酶解玉米胚芽脫脂粕預(yù)處理最優(yōu)的條件是A2B2C3(超聲功率360 W×40%，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度55 ℃)。由表3可知，超聲功率對超聲波輔助酶解玉米胚芽脫脂粕預(yù)處理具有極顯著影響，超聲時(shí)間也具有極顯著影響，超聲功率較超聲時(shí)間更為顯著，但超聲溫度卻無顯著性差異。通過最優(yōu)條件反應(yīng)后得到的玉米胚芽脫脂粕酶解液的水解度為36.58%，其上清液中的抗氧化活性為514.67 U/mL，可溶性蛋白含量為21.06 mg/mL。

2.5 玉米胚芽粕的超聲波酶解效果比較

玉米胚芽粕分別采用水浴雙酶水解、超聲波預(yù)處理+水浴雙酶水解、超聲波對整個(gè)酶解過程的處理3種處理方法，結(jié)果見表4。

表4 玉米胚芽粕不同處理酶解效果的比較 Table 4 Comparison of enzymatic hydrolysis effects of corn germ meal under different treatments

由表4可知，采用超聲波預(yù)處理后再用水浴雙酶水解方法水解后得到的玉米胚芽粕酶解物的水解度高于水浴雙酶水解，又遠(yuǎn)高于超聲波對整個(gè)酶解過程的處理方法；超聲波預(yù)處理后再水浴雙酶水解方法作用后的酶解物的可溶性蛋白含量也高于水浴雙酶水解以及超聲波對整個(gè)酶解過程的處理方法；超聲波預(yù)處理后再用水浴雙酶水解處理過的酶解物表現(xiàn)出的抗氧化活性是其他兩種酶解方法近2倍的效果。以上證明，采取超聲波預(yù)處理后再水解較傳統(tǒng)水解方法而言，是一種更優(yōu)的水解預(yù)處理?xiàng)l件，這種方法可以促使底物更充分反應(yīng)，提高水解效率。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以玉米胚芽粕為研究對象，以水解度、水解物中可溶性蛋白含量及抗氧化活性為指標(biāo)，在玉米胚芽粕水解時(shí)采用超聲波(超聲功率、超聲時(shí)間以及超聲溫度各不相同)對其進(jìn)行預(yù)處理，經(jīng)數(shù)據(jù)處理分析可知，超聲功率360 W×40%，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度55 ℃是超聲波預(yù)處理的最優(yōu)條件。并且超聲波預(yù)處理后再水浴雙酶水解是更為合理的方法，促使水解后的酶解物的抗氧化活性大幅度提升。為能夠更高效水解底物提供了新的研究思路，也為超聲波的深入研究提供了理論依據(jù)。