徐顯睿 李翠鳳 張宗博 李道河 隋勇軍 陳政言 張?zhí)m威

（1青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司食品實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266000） （2青島諾和諾康實(shí)業(yè)有限公司，山東青島 266000）（3中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266000）

乳雙歧桿菌具有調(diào)節(jié)腸道，促進(jìn)腸道健康，提高免疫力，抑制有害菌生長和預(yù)防胃腸疾病等多種生理功能。為了將乳雙歧桿菌產(chǎn)業(yè)化并用于乳品、保健品和各類功能食品中，通常采用高密度培養(yǎng)方式提高菌體活菌數(shù)，獲得盡可能高的體積生產(chǎn)率。高密度培養(yǎng)是通過較短的發(fā)酵周期和較低的發(fā)酵體積，從而降低益生菌產(chǎn)業(yè)化成本，加快益生菌相關(guān)產(chǎn)品的商業(yè)化發(fā)展進(jìn)程，進(jìn)而提高產(chǎn)品的市場競爭力。因此對于益生菌功能性食品，乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)極其關(guān)鍵。

乳雙歧桿菌Z-1 是一株經(jīng)篩選具有潛在益生功能的菌株，具有較強(qiáng)的耐胃酸、耐腸液能力和細(xì)胞黏附性。本試驗(yàn)對乳雙歧桿菌Z-1 的培養(yǎng)基進(jìn)行系統(tǒng)化分析，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，以期對乳雙歧桿菌Z-1 凍干菌粉的產(chǎn)業(yè)化提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乳雙歧桿菌Z-1（Bifidobacteriumlactis Z-1），由青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司食品實(shí)驗(yàn)室菌種資源庫保藏。葡萄糖、蔗糖、乳糖、大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、檸檬酸銨、牛肉膏、酵母膏、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉、吐溫80、L-半胱氨酸鹽酸鹽，均為分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胡蘿卜汁，福建綠泉食品有限公司；玉米漿，廣西百果園果汁有限公司；麥芽汁，煙臺(tái)麥特爾生物技術(shù)有限公司；莫匹羅星鋰鹽，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂，北京索萊寶科技有限公司。

改良MRS 液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、牛肉膏1%、磷酸氫二鉀0.12%、檸檬酸銨0.26%、硫酸鎂0.058%、硫酸錳0.005%、吐溫80 0.15%、L-半氨酸鹽酸鹽0.1%。

乳雙歧桿菌固體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：乳糖2%、胰蛋白胨0.5%、大豆蛋白胨1.5%、酵母膏0.3%、牛肉膏0.4%、吐溫80 0.1%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.1%、莫匹羅星鋰鹽0.005%、瓊脂1.5%。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

YXQ-LS-50SⅡ型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F 型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；AG050 型，厭氧培養(yǎng)罐：廣州雷得生物技術(shù)有限公司；SE6001FZH，電子天平美國奧豪斯公司；MEI04E型，分析天平梅特勒托利多公司；PHS-3C 型，pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LRH-250 型，生化培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MX-S 型，旋渦振蕩器美國賽洛捷克公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化

將乳雙歧桿菌Z-1 接種到改良MRS 液體培養(yǎng)基中，按1%接種量進(jìn)行活化，經(jīng)2 次傳代，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)12 h 獲得對數(shù)生長期的菌液。

1.2.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基

將經(jīng)活化2 代的菌體接種到2%不同碳源（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、1%不同氮源（蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨）、3%不同生長因子（胡蘿卜汁、麥芽汁、玉米漿） 的改良MRS 液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)12 h，采用乳雙歧桿菌固體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基按GB 4789.34—2016 方法進(jìn)行活菌數(shù)測定。

1.2.3 Plackett-Burman 篩選設(shè)計(jì)

以1.2.2 優(yōu)化的增菌培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過Plackett-Burman 設(shè)計(jì)，從11 種培養(yǎng)基成分中篩選出對乳雙歧桿菌Z-1 菌數(shù)有顯著性影響的因素。

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

為更好地建立響應(yīng)面擬合方程，確定最佳響應(yīng)值區(qū)域，采用最陡爬坡試驗(yàn)近一步確定主要影響乳雙歧桿菌Z-1 菌數(shù)因素的最優(yōu)濃度。該試驗(yàn)以

1.2.3 中結(jié)果確定各顯著因素爬坡方向及步長。

1.2.5 BBD 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化增菌培養(yǎng)基

響應(yīng)面分析采用多元二次回歸方程擬合因素和響應(yīng)值間的關(guān)系。通過對乳雙歧增菌培養(yǎng)基成分中的顯著性影響因素與菌體濃度之間的擬合，優(yōu)化培養(yǎng)基中的關(guān)鍵成分，獲得優(yōu)化培養(yǎng)基。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert8.0 軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源的選擇

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，分別按2%（乳糖和葡萄糖各1%） 添加不同碳源、按1%（蛋白胨和胰蛋白胨各0.5%） 添加不同氮源、按3%（麥芽濃縮汁和玉米漿各1.5%） 添加不同生長因子的增菌效果不同。其中乳糖作為碳源增菌效果最好，培養(yǎng)12 h 活菌數(shù)為1.9×109CFU/mL；胰蛋白胨為增菌效果最好的氮源，培養(yǎng)12 h 活菌數(shù)為1.53×109CFU/mL；玉米漿為增菌效果最好的生長因子，培養(yǎng)12 h 活菌數(shù)為1.84×109CFU/mL。因此選擇乳糖、胰蛋白胨和玉米漿為增菌培養(yǎng)基的碳源、氮源和生長因子，20 g/mL 乳糖、10 g/mL 胰蛋白胨和30 g/mL 麥芽汁為響應(yīng)面試驗(yàn)的因素低水平取值。

2.2 Plackett-Burman 試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乳糖、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、磷酸氫二鉀、檸檬酸銨、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80、L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿共11 種組分進(jìn)行N=20 的Plackett-Burman 試驗(yàn)，確定對乳雙歧桿菌Z-1 菌量具有顯著影響的因素。

采用PB 試驗(yàn)進(jìn)行因素篩選，采取+1 水平是-1水平的2 倍進(jìn)行設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值及分析見表1、表2 和表3。

表1 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的變量及不同水平的用量

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 PB 試驗(yàn)顯著性分析表

由表3 可以看出，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，影響菌量的極顯著因素共有4 個(gè)，其中磷酸氫二鉀貢獻(xiàn)率為36.33，硫酸鎂貢獻(xiàn)率為10.27，L-半胱氨酸鹽酸鹽貢獻(xiàn)為19.70；玉米漿貢獻(xiàn)率為28.32。由此得出擬合回歸模型方程如下：

菌數(shù)Y=72.77-0.87A+1.13B-0.77C-0.27D+6.83E -0.27F+3.63G+0.37H -0.77J+5.03K +6.03L。

由方差分析表可知，模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.64，P＜0.05），調(diào)整R2為0.936 9，說明菌數(shù)的變化93.69%是由所選因素引起的。本模型中信噪比值為16.053，說明了模型的充分性和合理性。在所選因素中磷酸氫二鉀、硫酸鎂、L-半胱氨酸鹽酸鹽、玉米漿對菌數(shù)的影響在0.01 水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且為正向影響。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)PB 試驗(yàn)，磷酸氫二鉀、硫酸鎂、L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿均為正效應(yīng)，故爬坡方向均向上。以磷酸二氫鉀方程系數(shù)為基準(zhǔn)量分別確定各顯著因素濃度，具體見表4、表5。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)各因素步長水平表

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表5 看出，因素水平在原點(diǎn)+4△處菌量達(dá)到最大，之后菌量減少，最大值出現(xiàn)的響應(yīng)區(qū)間在因素水平4 附近，選擇因素水平4 作為中心點(diǎn)。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

以磷酸氫二鉀、硫酸鎂、L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿為自變因素，采用響應(yīng)面法對最佳培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及結(jié)果

運(yùn)用Box-Behnken 組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對磷酸氫二鉀（A）、硫酸鎂（B）、L-半胱氨酸鹽酸鹽（C） 和玉米漿（D） 進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平和結(jié)果分別見表6 和表7。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

利用Design-Expert 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y（菌量）=105.99 +3.43A -1.90B +0.68C +1.84D -3.17AB -2.28AC -3.16AD+0.32BC+3.57BD -0.66CD -2.87A2-6.10B2-7.55C2-8.66D2。菌量響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果見表8。

由表8 方差分析結(jié)果可知，模型F=23.56，P＜0.0001 差異極顯著，且失擬項(xiàng)p＞0.05，故說明該模型顯著。模型的R2=0.9593，說明擬合程度很好，且R2Adj=0.918 6，R2pre=0.782 7，方差相差很小，說明可信度高，可以用此模型來分析預(yù)測最優(yōu)培養(yǎng)基。

對單因素來講，磷酸氫二鉀、硫酸鎂和玉米漿對菌量影響均顯著，L-半胱氨酸鹽酸鹽對菌量影響不顯著，各因素對菌量影響程度為A＞B＞D＞C。對于交互作用來說，磷酸氫二鉀和硫酸鎂、磷酸氫二鉀和L-半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸氫二鉀和玉米漿以及硫酸鎂和玉米漿交互作用對菌量的影響顯著（P＜0.05），硫酸鎂和L-半胱氨酸鹽酸鹽以及L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿交互作用對菌量的影響不顯著（P＞0.05），對于模型的二次項(xiàng)來說均顯著。

2.4.3 響應(yīng)面結(jié)果及分析

不同因素兩兩交互作用對菌量的影響結(jié)果見圖1～圖6。

表8 菌量響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析

圖1 磷酸氫二鉀和硫酸鎂交互作用對菌量的影響

圖2 磷酸氫二鉀和L-半胱氨酸鹽酸鹽交互作用對菌量的影響

圖3 磷酸氫二鉀和玉米漿交互作用對菌量的影響

圖4 硫酸鎂和L-半胱氨酸鹽酸鹽交互作用對菌量的影響

圖5 硫酸鎂和玉米漿交互作用對菌量的影響

圖6 L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿交互作用對菌量的影響

由圖1 可知，磷酸氫二鉀和硫酸鎂交互作用對菌量影響的等高線圖為橢圓形，說明對菌量影響顯著。當(dāng)硫酸鎂不變時(shí)，隨著磷酸氫二鉀的增加，菌量呈迅速上升趨勢；當(dāng)磷酸氫二鉀不變時(shí)，隨著硫酸鎂增加，菌量呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)磷酸氫二鉀為3.3 g/L，硫酸鎂為1.0 g/L 左右時(shí)菌量達(dá)到最大值。

圖2 反映了磷酸氫二鉀和L-半胱氨酸鹽酸鹽交互作用對菌量的影響，等高線圖為橢圓形，說明對菌量影響顯著，當(dāng)L-半胱氨酸鹽酸鹽不變，隨著磷酸氫二鉀的增加，菌量先迅速上升后變化平緩；當(dāng)磷酸氫二鉀不變時(shí)，隨著L-半胱氨酸鹽酸鹽增加，菌量呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)磷酸氫二鉀為3.3 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽為2.4 g/L 左右時(shí)菌量取得最大值。

從圖3 可以看出，磷酸氫二鉀和玉米漿間交互作用對菌量的影響與圖1 相似，菌量在磷酸氫二鉀為3.3 g/L，玉米漿為82.5 g/L 時(shí)取得最大值。

圖4 反映了硫酸鎂和L-半胱氨酸鹽酸鹽交互作用對菌量的影響，對菌量影響的等高線圖近似圓形，說明此因素對結(jié)果影響不顯著。但當(dāng)固定一個(gè)變量，菌量會(huì)隨著另一個(gè)變量的增大先上升后下降，但隨著因素值的改變，菌量變化不是很明顯。當(dāng)硫酸鎂為1.0 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽為2.48 g/L時(shí)菌量最高。

由圖5 可知，硫酸鎂和玉米漿交互作用對菌量影響的等高線圖為橢圓形，說明影響顯著，隨著因素的增加，菌量上升，在硫酸鎂為1.0 g/L，玉米漿為82.5 g/L 左右達(dá)到最大值，然后菌量出現(xiàn)下降。

圖6 為L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿交互作用對菌量的影響，等高線圖為圓形，說明對菌量的影響不顯著，在L-半胱氨酸鹽酸鹽為2.48 g/L，玉米漿為83.0 g/L 取得最大值。

由圖1～圖6 可知，響應(yīng)面圖均為開口向下的凸面，故響應(yīng)值R 存在極大值，為進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)果，根據(jù)Design-Expert 軟件得出在磷酸氫二鉀、硫酸鎂、L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿交互影響下，菌量最優(yōu)條件為：磷酸氫二鉀3.228 g/L，硫酸鎂0.972 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽2.451 g/L，玉米漿81.298 g/L，在此條件下模型預(yù)測的菌量107.329×108CFU/mL。在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)12 h，實(shí)際菌量為104.67×108CFU/mL，因此該模型可較好預(yù)測乳雙歧桿菌Z-1 的生長情況。

3 結(jié)論

乳雙歧桿菌作為最典型的具有益生功能的菌株，在益生菌產(chǎn)品市場中應(yīng)用極其廣泛。對乳雙歧桿菌Z-1 發(fā)酵菌數(shù)影響最顯著的因素為磷酸氫二鉀和硫酸鎂。礦物質(zhì)鹽具有促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用，Caterine 等指出鎂離子、鉀離子和鈣離子能促進(jìn)乳酸桿菌的增殖，是乳酸菌增殖必需的生長因子。玉米漿富含多種氨基酸、多肽類和維生素，并且含有還原糖及鉀、鎂、鈣、磷等礦物元素。研究表明，維生素可以提高菌體代謝途徑中的磷酸果糖激酶活性，促進(jìn)乳酸菌的生長代謝，還可以降低菌體在培養(yǎng)過程中的死亡率。此外，乳酸菌可直接利用氨基酸，而多肽類則由細(xì)胞內(nèi)的肽酶水解成為游離氨基酸被菌體利用。Etoh 等發(fā)現(xiàn)多肽類可顯著促進(jìn)雙歧桿菌的生長，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。L-半胱氨酸鹽酸鹽是乳雙歧桿菌生長最重要的氨基酸，但試驗(yàn)結(jié)果顯示增菌效果相對不顯著，可能與培養(yǎng)基中L-半胱氨酸鹽酸鹽的含量有關(guān)。但在交互作用中，磷酸氫二鉀與硫酸鎂、磷酸氫二鉀與L-半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸氫二鉀與玉米漿、硫酸鎂和玉米漿增菌效果均得到加強(qiáng)，表明礦物質(zhì)鹽對于高密度培養(yǎng)基至關(guān)重要，L-半胱氨酸鹽酸鹽與玉米漿交互作用對菌數(shù)不顯著，可能與培養(yǎng)基中兩者的添加量較多有關(guān)。

通過單因素試驗(yàn)、PB 試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)得出乳雙歧桿菌Z-1 最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：乳糖2%、胰蛋白胨1%、酵母膏0.5%、牛肉膏1%、磷酸氫二鉀0.322 8%、檸檬酸銨0.26%、硫酸鎂0.097 2%、硫酸錳0.005%、吐溫80 0.15%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.245 1%、玉米漿8.129 8%。