馬春華 陳文文 邢 越

（武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建武夷山 354300）

氟喹諾酮類藥是一類化學(xué)合成抗菌藥，對于多種革蘭陰性菌具有明顯的殺菌效果。氟喹諾酮類藥物是喹諾酮藥物發(fā)展到第3 代的產(chǎn)物，對組織細(xì)胞的穿透力加強(qiáng)，因而吸收好，抗菌譜和殺菌效果強(qiáng)，作用范圍廣，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛。氟喹諾酮類藥主要包括恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星，恩諾沙星在動物體內(nèi)代謝生成環(huán)丙沙星，在家禽體內(nèi)殘留形式以環(huán)丙沙星為主。隨著氟喹諾酮類藥物的廣泛使用，細(xì)菌耐藥和不良反應(yīng)也相繼發(fā)生。通過有效的分析技術(shù)，對動物性食品中的氟喹諾酮類藥物殘留進(jìn)行檢測，對于指導(dǎo)養(yǎng)殖業(yè)正確用藥，確保動物性食品安全具有十分重要的意義。

藥物殘留的檢測技術(shù)日益先進(jìn)，常用的有高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）、液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法及免疫法等。HPLC-MS 具有較高的靈敏度，但是由于儀器本身較昂貴，檢測成本高，適合科研院所；而高效液相色譜儀建立的分析方法在實際工作中有較好的應(yīng)用性與推廣性。食品樣品組成復(fù)雜，檢測前需要采用合適的樣品前處理方法，減少其他組分的干擾及基質(zhì)的影響。目前，檢測抗生素常用的前處理方法有液液萃?。↙LE），基質(zhì)固相分散（MSPD）、QuEChERS、結(jié)合固相萃取等方法。

國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定恩諾沙星與環(huán)丙沙星之和，在禽肉和其他動物肌肉中的最大殘留限量為100 μg/kg。本研究建立了一種QuEChERS-高效液相色譜快速測定雞肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星3 種喹諾酮類獸藥殘留的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥品與試劑

Agilent 1260 高效液相色譜儀，美國Agilent 有限公司；DN-12A 水浴氮吹儀，上海比朗儀器制造有限公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；渦旋混勻器，德國IKA 公司。依諾沙星（ENO）、諾氟沙星（NOR）、環(huán)丙沙星（CIP） 標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞99.0，北京百靈威科技有限公司。

N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18） 購自天津博納艾爾杰公司。

標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：準(zhǔn)確稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的溶液，4 ℃下避光保存。將各標(biāo)準(zhǔn)儲備液用0.2%甲酸水溶液稀釋，配成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 樣品前處理與凈化

將雞肉絞碎，稱取2.0 g 置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入2 mL 水，渦旋混勻后加入8 mL5%甲酸-乙腈溶液，渦旋30 s，再加入4 g 無水硫酸鎂、1 g氯化鈉，渦旋1 min 后，4 ℃的條件下8 000 r/min離心3 min，上清液全部轉(zhuǎn)移至凈化管，管中有50 mg PSA、150 mg C18，渦旋1 min，5 000 r/min 離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移到10 mL 聚丙烯離心管中，45 ℃水浴氮吹儀吹干，用1 mL 10%乙腈水溶液（2%甲酸） 復(fù)溶，用一次性無菌注射器吸取，過孔徑0.45 μm 有機(jī)相濾膜，上機(jī)測定。

1.3 色譜條件

洗脫程序：0 min～3 min，85% A+15% B；3 min～6 min，75% A+25 % B ；6 min～7 min，67.5%A+32.5%B；7 min～8 min，60%A+40%B；8 min～13 min，85%A+15%B。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件的選擇與優(yōu)化

運用色譜柱分離氟喹諾酮抗生素時，采用酸性流動相有比較好的分離效果。在利用HPLC 分析氟喹諾酮類抗生素殘留時，以乙腈為流動相常出現(xiàn)色譜峰拖尾等現(xiàn)象，當(dāng)以乙腈-甲酸溶液為流動相，沒有雜峰出現(xiàn)，分離效果較好。本研究采用乙腈和甲酸水溶液作為流動相，對比不同甲酸含量0.1%、0.2%和0.4%的分離效果，結(jié)果表明甲酸為0.2%時的出峰時間適中，峰形較好，峰面積最大，故選用0.2%甲酸水溶液（A 相） -乙腈（B 相） 作為流動相。

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

GB/T 20366—2066《動物源產(chǎn)品中喹諾酮類殘留量的測定》中樣品采用甲酸-乙腈提取，提取液用正己烷凈化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，氮氣流吹干。

選擇合適的提取劑很重要，對比乙腈、2%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈和EDTA-McIlvaine 的提取效果，比較同一濃度下已知樣品中氟喹諾酮類抗生素的回收率，可以得出5%甲酸乙腈作為提取溶液時測定結(jié)果的回收率最好，2%甲酸乙腈次之，EDTAMcIlvaine 回收率最低，結(jié)果如下頁圖1 所示。

2.2.2 凈化條件

查閱文獻(xiàn)可知，QuEChERS 方法常用的脫水劑主要是無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、檸檬酸鈉、氯化鈉等，常用吸附劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）。經(jīng)前期試驗確定凈化條件為：無水硫酸鎂4.0 g、氯化鈉1.0 g、C18用量150 mg、PSA 50 mg。

圖1 不同溶劑萃取效果比較

2.3 方法驗證

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量限

按照1.2 處理得到質(zhì)量濃度分別為1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg、40 μg/kg、80 μg/kg、100 μg/kg 的基質(zhì)加標(biāo)工作溶液，繪制各化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明3 種喹諾酮類獸藥濃度在1 μg/kg～100 μg/kg 線性關(guān)系良好，R2均大于0.99（表1）。在空白雞肉樣品中分別添加0.1 μg/kg、0.3 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、4.0 μg/kg 的3 種氟喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（n=5），經(jīng)樣品前處理后檢測，以各化合物響應(yīng)值大于3 倍信噪比（S/N） 時對應(yīng)的加標(biāo)水平為方法檢出限（LOD），10 倍信噪比為定量限，本方法檢出限為0.3 μg/kg，方法定量限為1.0 μg/kg。

羅靜等采用基質(zhì)固相分散－液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留，檢出限0.1 μg/kg；夏駿等采用QuEChERS-HPLC-MS 法測動物源性食品中氟喹諾酮類藥物殘留量，檢出限2.0 ng/g～3.0 ng/g。本研究采用QuEChERS 技術(shù)對樣品進(jìn)行處理，分散固相萃取對樣品凈化，液相色譜進(jìn)行檢測，可以達(dá)到比較低的檢測限，節(jié)省時間，對檢測設(shè)備要求不高，可以滿足日常檢測的需要。

2.3.3 方法的精密度與準(zhǔn)確度

稱取2 g 絞碎混勻的雞肉，然后向其添加2 種不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL、20.0 μg/mL），按本研究方法進(jìn)行測定，計算出平均回收率為83.3%～112.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 為3.2%～6.7%，結(jié)果如表2 所示。

表1 線性方程和相關(guān)系數(shù)

表2 氟喹諾酮類藥物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.3.4 實際樣品測定

采用本方法對市場上10 個樣品進(jìn)行分析，結(jié)果有2 個雞肉樣品檢測出環(huán)丙沙星，檢測結(jié)果分別為5.7 μg/kg、11.6 μg/kg，市場上雞肉喹諾酮類藥物殘留未超出限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS 方法結(jié)合高效液相色譜法檢測雞肉中環(huán)丙沙星、諾氟沙星、依諾沙星殘留的方法。采用QuEChERS 凈化技術(shù)，操作簡便,縮短樣品處理時間，提高檢測效率。該方法測定3種氟喹諾酮類藥物的最低定量限為1.0 μg/kg，能夠更好地滿足國家規(guī)定的要求，可用于日常檢測。