李 艷，周露秋，任黔川

0 引言

宮頸癌(Cervical cancer，CC)是危害女性健康的主要惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在全世界女性惡性腫瘤中居第4位[1]。近年來，雖然我國宮頸癌整體死亡率在宮頸癌普查和人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)疫苗的積極推廣下有所下降，但城市婦女死亡率仍呈持續(xù)上升趨勢[2-3]，給宮頸癌的治療帶來巨大挑戰(zhàn)。目前，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，中草藥在宮頸癌的治療中發(fā)揮著積極作用[4-6]。吉馬酮(Germacrone)作為中草藥姜黃提取物中的主要生物活性成分之一，具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎等[7-13]，但吉馬酮在宮頸癌中的作用國內(nèi)外尚無報道。本實驗擬探討吉馬酮對人宮頸癌Hela細(xì)胞的作用及其機(jī)制，為宮頸癌藥物研發(fā)提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 吉馬酮(Solarbio，批號：423B0-22)；MEM培養(yǎng)基(Procell，批號：WH01111905XP)；青鏈霉素雙抗(Hyclone，批號：J180034)；胎牛血清(CLARK，批號：JC63468)；CCK-8試劑盒(Beyotime，批號：68121000);Transwell小室(Corning，批號：05619049)；人工基底膜Matrigal(Corning，批號：9056014)；Annexin V-APC/PI試劑盒(批號：20190809)與細(xì)胞周期檢測試劑盒(批號：20190805)均購自KeyGEN bioTECH公司；Bax抗體(Abcam，批號：ab32503)；Bcl-2抗體(Affinity,批號：AF6139)。倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；臺式高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀儀器廠)；Western blot電泳儀(北京市六一儀器廠)等。

1.2 細(xì)胞株 人宮頸癌Hela細(xì)胞株(西南醫(yī)科大學(xué)中心實驗室)。

1.3 方法

1.3.1 藥物配置 將11 mg吉馬酮溶于500 μl的二甲基亞砜(DMSO)中，制備成100 mmol/L的母液，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將 Hela細(xì)胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)液(青霉素100 U/ml、鏈霉素 100 μg/ml、10%胎牛血清)中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長密度為80%～90%時，按1∶3傳代培養(yǎng)。

1.3.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期Hela細(xì)胞，加入培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度4×104/ml，100 μl/孔接種于96孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2恒溫中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的吉馬酮(0、40、80、120、160、200、240、280 μmol/L)；待藥物分別作用24 h、48 h、72 h后，向每孔中分別加入10 μl CCK-8溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻，培養(yǎng)箱中孵育3 h后，置于酶標(biāo)儀，測定其在450 nm處的吸光度值(OD值)，并計算生長抑制率。

1.3.4 Transwell檢測細(xì)胞遷移 取對數(shù)生長期Hela細(xì)胞，加入培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度1×105/ml，2 ml/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔；各組分別加入不同濃度的吉馬酮(0、120、180、240 μmol/L)處理24 h，消化清洗后用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度2.5×105/ml，200 μl/孔接種于Transwell上室中，600 μl含10%血清的培養(yǎng)基加入Transwell下室，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)12 h，PBS洗滌后加入100%乙醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗去多余結(jié)晶紫，濕潤棉簽擦拭上室面的濾膜后，對小室外側(cè)的細(xì)胞進(jìn)行拍照；加入33%醋酸進(jìn)行溶解，再置于酶標(biāo)儀測定其在570 nm處的OD值。

1.3.5 Transwell檢測細(xì)胞侵襲 將Matrigel基質(zhì)膠從-20 ℃冰箱中取出，并置于4 ℃冰箱過夜融化，在冰上將Matrigel與無血清培養(yǎng)基以1∶8的比例稀釋，吸取100 μl加入Transwell的上室底部，放置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，加入100 μl無血清培養(yǎng)基水化30 min。取出6孔板，其余步驟同“1.3.4”項，置于倒置顯微鏡下拍照(100×)、計數(shù)，計數(shù)時在同一倍鏡選取6個不同視野，取平均值。

1.3.6 Annexin V-APC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期Hela細(xì)胞，加入適量培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度1×105/ml，2 ml/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2恒溫中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，依次加入不同濃度的吉馬酮(0、120、180、240 μmol/L)干預(yù)24 h。消化收集細(xì)胞后，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌離心細(xì)胞2次，用500 μl的Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-APC混勻后，再加入5 μl的PI混勻；室溫避光10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.3.7 PI單染法檢測細(xì)胞周期 藥物干預(yù)步驟同“1.3.5”項；干預(yù)24 h后洗滌消化收集細(xì)胞，緩慢加入-20 ℃預(yù)冷的75%的冷乙醇，重懸細(xì)胞，4 ℃固定過夜；3 000 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，加入配制好的500 μl PI/RNase A染色工作液(現(xiàn)配現(xiàn)用。將Rnase A∶PI工作液按1∶9體積配制)，室溫避光30 min后，置流式細(xì)胞儀檢測,用CytExpert分析軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.3.8 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白 不同濃度吉馬酮培養(yǎng)細(xì)胞24 h，收集并裂解細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，定量，變性；每孔加入40 μg蛋白進(jìn)行電泳分離；將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入封閉液室溫?fù)u床封閉2 h；洗膜后加入一抗β-catenin(1∶100 000)、Bax(1∶2 000)、Bcl-2(1∶500)，4 ℃孵育過夜；PBST洗膜后加入稀釋后(1∶5 000)的二抗，室溫孵育2 h；最后加入適量ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀曝光拍照并統(tǒng)計灰度值，計算相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 吉馬酮對Hela細(xì)胞增殖的影響 CCK-8實驗結(jié)果提示，不同濃度吉馬酮(0、40、80、120、160、200、240、280 μmol/L)作用宮頸癌Hela細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞生長抑制率情況見圖1，與空白對照組(細(xì)胞生長抑制率為0)相比，在相同濃度下，培養(yǎng)時間越長，細(xì)胞增殖抑制率差別不大，不具有時間依賴性(P>0.05)；在同樣培養(yǎng)時間下，隨著藥物濃度升高，細(xì)胞的生長抑制率增強(qiáng)，呈現(xiàn)濃度依賴性(P<0.05)。24 h的IC50=182.09 μmol/L。

2.2 吉馬酮對Hela細(xì)胞遷移和侵襲的影響 經(jīng)不同濃度的吉馬酮(0、120、180、240 μmol/L)處理Hela細(xì)胞24 h后，遷移實驗結(jié)果如圖2所示，隨著吉馬酮濃度的增加，其OD值減小(P<0.01)；侵襲實驗結(jié)果如圖3所示，隨著吉馬酮濃度的增加，穿過小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，呈濃度依賴性(P<0.01)。上述結(jié)果說明，吉馬酮可以明顯減弱宮頸癌Hela細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

圖1 不同濃度吉馬酮對Hela細(xì)胞增殖能力的影響(n=3)

2.3 吉馬酮對Hela細(xì)胞凋亡能力的影響 經(jīng)不同濃度的吉馬酮(0、120、180、240 μmol/L)處理Hela細(xì)胞24 h后，Annexin V-APC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果如圖4所示，隨著藥物濃度的增加，總凋亡率明顯增加，且與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示吉馬酮可以呈劑量依賴性誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。見表1。

2.4 吉馬酮對Hela細(xì)胞凋亡周期的影響 用不同濃度吉馬酮(0、120、180、240 μmol/L)處理Hela細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示，隨著藥物濃度的增大，處于G1、G2期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞隨著藥物濃度的增大而增加，且與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示給藥后的Hela細(xì)胞凋亡周期可被阻滯于S期。見圖5。

圖2 吉馬酮對Hela細(xì)胞遷移的影響(n=3)

圖3 吉馬酮對Hela細(xì)胞侵襲的影響(n=3)

表1 不同濃度吉馬酮對Hela細(xì)胞凋亡率的影響(n=3)

圖4 吉馬酮對Hela細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

圖5 不同濃度吉馬酮對Hela細(xì)胞周期分布的影響(n=3)

2.5 吉馬酮對Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 用不同濃度吉馬酮(0、120、180、240 μmol/L)處理Hela細(xì)胞24 h后，通過蛋白印跡檢測細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平，見圖5。結(jié)果顯示，在180 μmol/L和240 μmol/L吉馬酮藥物作用下，Bax蛋白與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著藥物濃度增加，Bax蛋白相對表達(dá)增加。同時，吉馬酮以濃度依賴的方式下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖6。

3 討論

近年來，中草藥在抗宮頸癌新藥研究和治療中備受關(guān)注[14-15]。吉馬酮在多種腫瘤細(xì)胞中具有抗腫瘤活性，如可抑制肺癌NCI-H460細(xì)胞的增殖[16]。張淑琴等[8]研究發(fā)現(xiàn)，吉馬酮對肝癌HepG2細(xì)胞增殖有抑制作用。本研究CCK-8實驗結(jié)果提示，吉馬酮對宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制作用隨濃度增加而增強(qiáng)，呈濃度依賴性，提示吉馬酮可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖。

圖6 吉馬酮對Hela細(xì)胞的Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(n=3)

研究發(fā)現(xiàn)，吉馬酮抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與阻滯G2/M期細(xì)胞周期相關(guān)[8]，此外，體外研究結(jié)果表明吉馬酮可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期發(fā)生的G1期阻滯[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，吉馬酮可以誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生S期細(xì)胞周期阻滯，使其無法進(jìn)入正常細(xì)胞周期，從而抑制其增殖。

研究表明，有多種天然化合物可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡[17-19]。本研究結(jié)果表明，吉馬酮可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨著藥物濃度的增加而增加，呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性，證實吉馬酮對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖具有抑制作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。

研究表明，凋亡蛋白抑制家族、Bcl-2家族等一系列基因激活、調(diào)控及表達(dá)等在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[19-20]。其中,Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xl等)和促凋亡蛋白(Bax、Bok等)是近年來細(xì)胞凋亡研究的熱點(diǎn)蛋白，主要參與調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑[21]。Bcl-2具有穩(wěn)定線粒體膜并抑制細(xì)胞色素C釋放的抗凋亡功能，Bax是Bcl-2蛋白活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可激活凋亡蛋白結(jié)合位點(diǎn)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax比例可以反映細(xì)胞凋亡的情況[22]。本研究結(jié)果表明，吉馬酮可以濃度依賴性下調(diào)Bcl-2蛋白和上調(diào)Bax蛋白，進(jìn)一步證實了吉馬酮促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能與下調(diào)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

細(xì)胞侵襲和遷移在癌細(xì)胞發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，研究表明，中草藥可以削弱宮頸癌Hela細(xì)胞的侵襲遷移能力[4-5]。Lim等[13]研究發(fā)現(xiàn)，吉馬酮對乳腺癌細(xì)胞的遷移有抑制作用。李冰等[7]研究表明，吉馬酮可以通過降低VEGF的表達(dá)，進(jìn)一步抑制人非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770的侵襲遷移能力。本研究結(jié)果提示，吉馬酮以濃度依賴性方式抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的侵襲及遷移能力。

綜上所述，吉馬酮可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力和誘導(dǎo)發(fā)生S期周期阻滯，且可通過下調(diào)Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡。本研究從細(xì)胞和分子水平初步探討吉馬酮對宮頸癌Hela細(xì)胞的影響，探索其發(fā)揮藥物作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為臨床治療宮頸癌提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。