劉琳玲，宋興超，叢波，劉宗岳，宋姍姍，楊福合，王桂武

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130112）

貂皮是中國(guó)“東北三寶”（新三寶：人參、貂皮、鹿茸）之一，素有“皮中之王”的美稱。貂皮是珍貴的裘皮，其皮板優(yōu)良，輕柔結(jié)實(shí)，毛絨豐厚、細(xì)密、平齊，色澤光潤(rùn)，有彈性。針毛和絨毛的長(zhǎng)度是影響貂皮毛絨質(zhì)量的重要因素之一。水貂育種工作中，毛絨品質(zhì)的選育目標(biāo)為針毛短、平、齊，絨毛細(xì)、密，且針、絨毛比例適中，因此，毛長(zhǎng)性狀在水貂新品種選育及培育過(guò)程中尤為重要。目前，國(guó)內(nèi)飼養(yǎng)量較多的水貂品種主要有紅眼白水貂、丹麥咖啡水貂和美國(guó)短毛黑水貂等[1]。通過(guò)篩選與水貂毛長(zhǎng)性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）位點(diǎn)，運(yùn)用分子標(biāo)記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）方法可以進(jìn)一步加快水貂品種選育進(jìn)展。據(jù)研究表明，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5（fibroblast growth factor 5，F(xiàn)GF5）是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的成員之一。FGF5 基因是通過(guò)影響毛囊生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短進(jìn)而影響被毛長(zhǎng)度的調(diào)控基因[2-3]。FGF5 基因的隱性突變會(huì)導(dǎo)致反常的長(zhǎng)毛現(xiàn)象已經(jīng)在人類[4]及兔[5]、貓[6]、狗[7]、鯨目動(dòng)物[8]、羊駝[9]和羊[10]等動(dòng)物上得到驗(yàn)證。叢波等[11]研究表明，美國(guó)短毛黑水貂針毛平均長(zhǎng)度為（2.02±0.22）cm、絨毛平均長(zhǎng)度為（1.69±0.13）cm；丹麥咖啡色水貂針毛平均長(zhǎng)度為（2.58±0.21）cm、絨毛平均長(zhǎng)度為（2.11±0.29）cm，丹麥咖啡水貂針毛和絨毛都顯著長(zhǎng)于美國(guó)短毛黑水貂。本研究以被毛長(zhǎng)度存在顯著差異的美國(guó)短毛黑水貂和丹麥咖啡水貂為研究對(duì)象，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)―限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測(cè)FGF5 基因多態(tài)性，并對(duì)FGF5基因多態(tài)性與毛長(zhǎng)性狀進(jìn)行相關(guān)分析，旨在為今后研究水貂毛絨品質(zhì)的分子遺傳機(jī)理與分子標(biāo)記輔助選擇育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所毛皮動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地和大連名威貂業(yè)有限公司采集7 月齡左右、雄性水貂血樣，其中，美國(guó)短毛黑水貂115 只，丹麥咖啡水貂137只。在水貂取皮期，采集心臟血液，檸檬酸鈉抗凝，在﹣ 20 ℃的條件下保存。

1.2 主要試劑

全血基因組試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；限制性內(nèi)切酶 TaqⅠ（賽默飛世爾公司）；Marker和Taq DNA 聚合酶（大連TaKaRa 有限公司）。

1.3 DNA 提取

采用全血基因組試劑盒提取血液DNA，利用0.7%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，紫外分光光度法測(cè)定基因組的濃度和純度，在﹣20 ℃的條件下保存。

1.4 引物合成及 PCR 擴(kuò)增

以GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中水貂FGF5 基因序列（登錄號(hào)：JF288167.1）為參考，利用 Primer Premier 5.0 軟件在其內(nèi)含子1 和外顯子1 區(qū)域設(shè)計(jì)1 對(duì)引物FGF51-R（5′-AGGGCTATCACTAAAGCCGC-3′）和 FGF51-S（5′-TGGGGAGAGGAACCTCGATT-3′），由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。

PCR 反應(yīng)程序如下：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 30 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，共 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；在4 ℃條件下保存。

1.5 SNP 分析

先用30 個(gè)美國(guó)短毛黑水貂的基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送交吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用DNAMAN 軟件對(duì)擴(kuò)增核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析并篩查SNP。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，在擴(kuò)增產(chǎn)物的 376處存在多態(tài)性，該位點(diǎn)位于FGF5 基因內(nèi)含子1 中。

1.6 PCR-RFLP 分析

利用NEBcutter V 2.0 在線酶切設(shè)計(jì)軟件（http://nc2.neb.com/NEBcutter2/）查詢限制性內(nèi)切酶，發(fā)現(xiàn)Taq I 可識(shí)別FGF5 基因T376C 位點(diǎn)的C 等位基因。

基因型鑒定：內(nèi)切酶TaqⅠ識(shí)別位點(diǎn)為AGTCGAT，正常情況下將621 bp 的擴(kuò)增序列酶切為376 bp 和245 bp 兩個(gè)片段。將能夠酶切的基因型定義為CC 基因型，不能酶切的基因型為TT 基因型，雜合子則為CT基因型。

對(duì) 115 只美國(guó)短毛黑水貂和 137 只丹麥咖啡水貂的基因采用PCR-RFLP檢測(cè)方法進(jìn)行FGF5 基因多態(tài)性檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用PopGen 32 軟件統(tǒng)計(jì)基因型頻率和等位基因頻率、純合度和雜合度等群體遺傳參數(shù)。使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行SNP位點(diǎn)與毛長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析，構(gòu)建線性分析模型，具體模型如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 FGF5 基因的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果及測(cè)序篩選 SNP

利用引物對(duì)30 只美國(guó)短毛黑水貂的FGF5 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在500～750 bp 間，與預(yù)期結(jié)果相一致。從圖1 可以看出，SNP 位點(diǎn)位于FGF5 基因內(nèi)含子1 區(qū)域的376 bp 處，經(jīng)分析處于TaqⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)內(nèi)。

圖1 CC、TC 和TT 基因型的測(cè)序峰圖Fig.1 The sequencing peak graph of CC, TC and TT genotypes

2.2 PCR-RFLP 檢測(cè)分析

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為621 bp，采用限制性內(nèi)切酶TaqⅠ對(duì)2 個(gè)水貂品種FGF5 基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖 2 可知，F(xiàn)GF5 基因 T376C 位點(diǎn)存在 3 種基因型，分別為 TT（621 bp）、TC（621、376 和 245 bp）和 CC（376 和 245 bp）。

圖2 FGF5 基因T376C 位點(diǎn)的酶切分析結(jié)果Fig.2 Results of FGF5 T376C locus digested with Ⅰenzyme

2.3 FGF5 基因型頻率和等位基因頻率分布

由表1 可知，美國(guó)短毛黑水貂群體中檢測(cè)到3 種基因型，以 CC 型居多，TC 型次之，TT 型最少，而 C 等位基因頻率高于T 等位基因頻率；咖啡水貂群體中以TC 型居多，CC 型次之，TT 型最少，而 C 等位基因頻率與T 等位基因頻率相差不大。

表1 FGF5 基因 T376C 位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率Table 1 Genotype frequency and allele frequency of FGF5 T376C locus

2.4 不同水貂品種 FGF5 基因 T376C 位點(diǎn)的遺傳多樣性分析

由表2 可知，T376C 多態(tài)位點(diǎn)在美國(guó)短毛黑水貂群體中為中度多態(tài)（0.25 ＜PIC ＜0.05），而在丹麥咖啡水貂群體中表現(xiàn)為高度多態(tài)（PIC ＞0.25）。2檢測(cè)結(jié)果表明，T376C 位點(diǎn)在美國(guó)短毛黑水貂群體處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，在丹麥咖啡水貂群體中顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。

表2 2 個(gè)水貂品種 T376C 位點(diǎn)遺傳多態(tài)性Table 2 Genetic polymorphism of T376C locus in two mink breeds

2.5 FGF5 基因 T376C 位點(diǎn)多態(tài)性與水貂毛長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表3 可知，T376C 位點(diǎn)形成的不同基因型在兩種水貂品種中差異極顯著（P ＜0.000 1），說(shuō)明該位點(diǎn)可能與水貂毛長(zhǎng)性狀相關(guān)。

表3 T376C 位點(diǎn)基因型與水貂毛長(zhǎng)表型的關(guān)聯(lián)分析Table 3 Relationship analysis between the genotype of T376C locus with hair length phenotype of mink

3 討論

美國(guó)短毛黑水貂和丹麥咖啡水貂均為國(guó)外引進(jìn)品種，是目前我國(guó)飼養(yǎng)量較多的水貂品種[12]。美國(guó)短毛黑水貂毛絨品質(zhì)優(yōu)良，針毛短、平、齊，絨毛細(xì)、密，分布均勻，皮板富有彈性，但繁殖力較低；丹麥咖啡水貂體型較大，繁殖力較高，被毛略粗糙，呈淺褐色或深褐色[13]。美國(guó)短毛黑水貂和丹麥咖啡水貂的毛絨品質(zhì)差異較大，因此，本研究選擇這2 個(gè)品種開(kāi)展毛絨品質(zhì)相關(guān)分子遺傳標(biāo)記研究。

FGF5 是毛囊從生長(zhǎng)期到休止期轉(zhuǎn)換的重要的影響因子，同時(shí)也被證明 FGF5 是體內(nèi)誘導(dǎo)退行期毛囊分泌和抑制毛發(fā)生長(zhǎng)的信號(hào)蛋白。目前，關(guān)于FGF5 基因突變導(dǎo)致動(dòng)物毛長(zhǎng)表型改變和FGF5 基因多態(tài)性的檢測(cè)方法均有報(bào)道[14-16]。本研究分析了FGF5 基因在不同水貂品種中的多態(tài)性，不同品種水貂群體遺傳學(xué)分析表明 T376C 位點(diǎn)在美國(guó)短毛黑水貂和丹麥咖啡水貂中的基因型頻率有很大的差異。在美國(guó)短毛黑水貂群體中以CC 基因型居多，而C 等位基因頻率高于T 等位基因頻率；在丹麥咖啡水貂群體中以TC 基因型居多，而C 等位基因頻率與T 等位基因頻率相差不大；經(jīng)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，品種間的基因型頻率差異極顯著（P＜0.01）。丹麥咖啡水貂針毛和絨毛都顯著長(zhǎng)于美國(guó)短毛黑水貂，據(jù)此推測(cè)，該位點(diǎn)可能與水貂毛長(zhǎng)性狀相關(guān)。T376C 位點(diǎn)在美國(guó)短毛黑水貂群體中為中度多態(tài)，而在丹麥咖啡水貂群體中表現(xiàn)為高度多態(tài)。T376C 位點(diǎn)在短毛黑水貂群體處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，與劉琳玲等[17]研究結(jié)果基本一致。然而，丹麥咖啡水貂群體在該位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，究其原因可能是因?yàn)槌Ｒ?guī)選擇育種對(duì)該品種水貂絨毛經(jīng)濟(jì)性狀產(chǎn)生一定的影響，并且本研究樣本量較少，后續(xù)尚需增加檢測(cè)數(shù)量及擴(kuò)大水貂品種范圍以進(jìn)一步驗(yàn)證本試驗(yàn)結(jié)果。

本研究基于 PCR-RFLP 技術(shù)[18]開(kāi)展了 2 個(gè)品種水貂群體T376C 位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)及其與毛長(zhǎng)性狀的相關(guān)性分析，結(jié)果表明，該位點(diǎn)與水貂毛長(zhǎng)性狀存在極顯著相關(guān)。絨山羊FGF5 基因多態(tài)性與絨長(zhǎng)度相關(guān)，蘇博美利奴羊FGF5基因多態(tài)性與其產(chǎn)毛性狀相關(guān)，兔的產(chǎn)毛量也被證實(shí)與該基因相關(guān)[5]。FGF5 基因T376C位點(diǎn)可能是影響水貂毛長(zhǎng)的主控位點(diǎn)，為水貂毛長(zhǎng)性狀分子遺傳標(biāo)記研究提供了一定的分子基礎(chǔ)[19]。