楊金宏， 彭云武， 陳正余， 孔衛(wèi)青

(安康學(xué)院 陜西省蠶桑重點實驗室， 陜西 安康 725000)

桑樹是桑屬(?？?植物，桑葉營養(yǎng)豐富，蛋白含量為18%～30%，有別于動物蛋白質(zhì)附帶膽固醇等有害物質(zhì)，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)源之一，是藥食兩用的植物資源。桑葉富含的黃酮、綠原酸、木犀草苷等桑葉多酚，黃酮具有降血壓、降血糖、抑制血清脂質(zhì)增加和抗粥樣硬化等藥理作用[1]；綠原酸具有抗菌解毒、消炎利膽的作用，是某些中藥制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)[2-3]；木犀草苷能夠消炎退腫、具有較強的呼吸道殺菌作用[4]，是亟待開發(fā)的特色植物資源。不同產(chǎn)地桑葉的活性物質(zhì)含量差異較大，如桑葉黃酮含量在0.75%～4.85%[5]，桑葉脫氧野尻霉素的含量在0.11～0.34%[6]，湖桑9001的蘆丁含量是白桑、雞桑、廣東桑的4倍[7]。同時，桑樹具有一定富硒能力，硒含量高于普通農(nóng)作物和一般植物[8]，高硒地區(qū)的中藥材中，桑樹的硒含量僅次于豆腐柴[9]。

安康地區(qū)蠶桑資源豐富，是全國優(yōu)質(zhì)繭絲綢生產(chǎn)基地之一，也是全國最大的富硒區(qū)之一，土壤平均硒含量達0.567 7 mg/kg[10]，在安康地區(qū)開發(fā)富硒桑葉食品具有產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢。安康地處秦巴山區(qū)東段，山勢縱橫，海拔落差大，氣候條件復(fù)雜，不同地域氣候土壤等環(huán)境條件差異大?；诖?，對來自安康市嵐皋縣堰門鎮(zhèn)，漢濱區(qū)五里鎮(zhèn)、大同鎮(zhèn)、沈壩鎮(zhèn)，石泉縣池河鎮(zhèn)的桑葉進行硒、總黃酮、總糖、綠原酸、木犀草苷含量及桑葉的總抗氧化能力進行測定分析，以期為當(dāng)?shù)馗晃Ｈ~資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 桑葉 試驗桑樹品種為湖桑32，分別采摘于安康市嵐皋縣堰門鎮(zhèn)，漢濱區(qū)五里鎮(zhèn)、大同鎮(zhèn)、沈壩鎮(zhèn)，石泉縣池河鎮(zhèn)，采摘地均為安康市中硒含量區(qū)[9-10]。各地隨機選取3棵桑樹采摘2～5葉位的桑葉，采摘時間為2019年11月中旬，采摘后于65℃干燥2 h至含水量為4.0%左右備用。

1.1.2 主要試劑 硒標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 000 μg/mL)為國家有色金屬及電子材料分析測試中心提供；綠原酸、木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品購于上海源葉生物科技有限公司；2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ)購自Sigma公司；乙腈、硝酸(優(yōu)純級)購自天津化學(xué)試劑廠；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、FeSO4、蘆丁、葡聚糖均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 桑葉總黃酮含量測定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法[11]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測定510 nm吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y= 2.51x+0.000 7(R2= 0.999 6)計算桑葉總黃酮含量。

1.2.2 桑葉總糖含量測定 參考3,5-二硝基水楊酸比色法[12]，以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，測定540 nm吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y= 0.300 2x-0.050 7(R2=0.995 7)計算桑葉總糖含量。

1.2.3 桑葉粗蛋白含量測定 利用凱氏定氮法測定[13]。

1.2.4 桑葉綠原酸、木犀草苷含量測定 用HPLC方法測定[14]。綠原酸含量測定流動相：1%乙酸水溶液∶甲醇為75∶25，測定波長280 nm；木犀草苷含量測定流動相：1%乙酸水溶液∶甲醇為1∶1，測定波長350 nm。分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y= 15.371x-15.504，R2=0.999 6和y= 28.271x-8.642(R2=0.999 9)計算桑葉綠原酸和木犀草苷含量。

1.2.5 桑葉硒含量測定 參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.268-2017《食品中硒的測定》的電感耦合等離子體質(zhì)譜法[15]。以硒溶液的濃度(0 μg/L，5 μg/L，10 μg/L，20 μg/L，30 μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y= 147.26x+ 41.603(R2= 0.999 8)計算桑葉硒的含量。

1.2.6 桑葉對羥自由基的清除率 利用Fenton反應(yīng)[16]和536 nm吸光度獲得桑葉清除羥自由基的能力。測定桑葉樣本吸光度值，記為A測，分別以蒸餾水代替樣品和H2O2測定記為A對和A空，根據(jù)公式D=(A測-A對)/(A空-A對)×100%計算羥自由基的清除率。

1.2.7 桑葉對鐵離子的還原力 利用TPTZ反應(yīng)[17]和593 nm吸光度測定樣本對鐵離子的還原力，獲得其總抗氧化活性。以FeSO4為對照，以1 g樣本1 min產(chǎn)生1 μmol Fe2+-TPTZ定義為1個酶活力單位。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y= 0.422 1x-0.004 8(R2=0.997 9)計算桑葉對鐵離子的還原力。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉主要活性成分含量

由表1可知，安康5個鎮(zhèn)的干桑葉總黃酮的含量為30.924～56.200 mg/g，平均38.341 mg/g，以池河鎮(zhèn)的最高?？偺呛繛?66.654～249.717 mg/g，平均206.820 mg/g，以堰門鎮(zhèn)的最高；綠原酸含量為242.685～512.277 μg/g，平均393.1524 μg/g，以五里鎮(zhèn)最高；木犀草苷含量在11.623～17.206 μg/g，平均12.8772 μg/g，以沈壩鎮(zhèn)最高；粗蛋白含量為10.703～19.245 μg/g，平均15.602 2 μg/g，以堰門鎮(zhèn)最高。從圖1看出，綠原酸的保留時間為8.817 min，木犀草苷的保留時間為5.160 min。

表1 不同產(chǎn)地桑葉(干重)的主要活性成分含量 Table 1 Content of main functional substances in mulberry leaves (dry weight) from different producing areas

2.2 桑葉的硒含量

由圖2可知，五里鎮(zhèn)桑葉的硒含量略低，為0.193 mg/kg，其他4個產(chǎn)地桑葉的硒含量均大于0.2 mg/kg，其中以大同鎮(zhèn)的最高，為0.358 mg/kg，其余依次為沈壩鎮(zhèn)、池河鎮(zhèn)和堰門鎮(zhèn)，含量分別為0.31 mg/kg、0.28 mg/kg和0.211 mg/kg。

2.3 桑葉的抗氧化活性

從圖3看出，對鐵離子還原力最高為池河鎮(zhèn)桑葉，為9 885.672 U/g，其次為五里鎮(zhèn)桑葉，為9 255.978 U/g，沈壩鎮(zhèn)、大同鎮(zhèn)和堰門鎮(zhèn)桑葉對鐵離子還原力分別為8 236.223 U/g、7 126.652 U/g和6 250.554 U/g。羥基自由基作用于體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物分子，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，進而導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂引起疾病。因此羥基自由基清除能力是樣品抗氧化能力的重要指標(biāo)之一。各地桑葉的羥基自由基清除率由高到低分別為堰門鎮(zhèn)(83.62%)、沈壩鎮(zhèn)(80.44%)、大同鎮(zhèn)(79.94%)、池河鎮(zhèn)(31.97%)、五里鎮(zhèn)(25.64%)。

2.4 桑葉主要功能物質(zhì)含量的變異度

從表2看出，變異系數(shù)以總糖的最小，為15.47%；其次是粗蛋白，為20.45%；最大的是木犀草苷，為24.34%。除總糖外，其他成分的變異系數(shù)都在20%以上，說明產(chǎn)地對桑葉不同指標(biāo)的影響不同。

表2 桑葉主要功能物質(zhì)含量的變異系數(shù) Table 2 Variable coefficient of main functional substance content in mulberry leaves

3 結(jié)論與討論

桑葉含有豐富的生物活性成分，其有效成分含量受產(chǎn)地環(huán)境、品種、取樣時間等影響較大。作為養(yǎng)蠶的物質(zhì)基礎(chǔ)，我國桑樹品種的選育主要指標(biāo)是區(qū)域試驗養(yǎng)蠶成績，即以家蠶的健康度為過程指標(biāo)，以絲蛋白為主要收獲方式[18]。安康以高原、山地為主，地形地貌復(fù)雜，形成了復(fù)雜多樣的山區(qū)立體小氣候。研究表明，安康不同產(chǎn)地桑葉的主要功能物質(zhì)含量不同，各成分變異最小的是多糖和蛋白。桑葉多糖具有抑菌效果，其含量和家蠶的健康度關(guān)系密切[19]，而蛋白含量的高低直接影響葉絲轉(zhuǎn)化。這與所有樣本均來自蠶區(qū)栽培桑園，以及以養(yǎng)蠶為目的的桑樹品種選育目標(biāo)一致。5個地點的桑葉樣本中，多糖含量最高的堰門桑葉對羥基自由基清除率也最高，是清除率最低的五里桑葉的3.26倍，這與桑葉多糖具有清除氧自由基及抗脂質(zhì)過氧化作用，清除化學(xué)模擬體系產(chǎn)生的羥基自由基的作用一致[20-21]。因此，在開發(fā)桑葉功能食藥用品時，需要充分了解原料來源及主要成分含量。

硒是人體必需的微量元素，參與合成人體內(nèi)多種含硒酶和含硒蛋白，具有抗氧化、延緩衰老、保護修復(fù)細(xì)胞、提高紅細(xì)胞的攜氧能力和人體免疫力等多種作用功能[22]。對大多數(shù)人而言，適量補充硒元素，對維持身體健康、預(yù)防某些疾病發(fā)生具有積極意義。根據(jù)富硒食品硒含量分類標(biāo)準(zhǔn)(DB 6124.01-2010)中蔬菜制品的硒含量指標(biāo)0.02～2.00 mg/kg，測定桑葉樣本的硒含量在0.193～0.358 mg/kg，達富硒食品硒含量標(biāo)準(zhǔn)，可用于開發(fā)富硒桑葉制品，研究結(jié)果可為當(dāng)?shù)匦Q桑資源的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)。