孔維松， 許 永， 李 晶， 劉 欣，王 晉， 黃海濤， 楊葉昆，李雪梅， 楊光宇

(云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650106)

艾葉是重要的醫(yī)藥和香料工業(yè)原料，有溫經(jīng)止血、散寒止痛、調(diào)經(jīng)安胎的作用[1]。艾草植株香氣濃烈，因其香韻獨(dú)特，可用于日用或食用香精的調(diào)配。艾葉中的主要有效成分包括揮發(fā)油、黃酮類、鞣質(zhì)類和多糖等[2-6]。利用艾葉制備的艾葉精油或浸膏添加到煙葉中，可在不影響卷煙燃燒的同時(shí)柔和卷煙煙氣，降低卷煙雜氣，賦予卷煙特殊的風(fēng)味。眾所周知，有效提取和定性定量分析煙用香精香料中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分，總結(jié)出該香精香料樣品的色譜指紋圖譜特征，就能得到在所有種類香精香料中代表其特有化學(xué)組分的指紋圖譜，從而達(dá)到質(zhì)量控制的目的。因此，對(duì)煙用香精香料中揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析具有非常重要的意義。

關(guān)于植物中的揮發(fā)性及半揮發(fā)性成分，目前常用的提取方法有溶劑萃取法[7]、同時(shí)蒸餾萃取法[8-10]、超臨界流體萃取法[11]、固相微萃取法[8-10，12]、頂空氣相色譜法[13]和吹掃捕集熱脫附解吸法[14]等，其中，頂空氣相色譜法、吹掃捕集熱脫附解吸法因分析結(jié)果重現(xiàn)性較差，多用于定性分析；同時(shí)蒸餾萃取中部分不穩(wěn)定組分長(zhǎng)期和熱水反應(yīng)會(huì)發(fā)生熱分解；溶劑萃取法因具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛使用。固體物質(zhì)的溶劑萃取通常采用冷浸法或索氏提取法 (熱浸法)，冷浸法是靠溶劑長(zhǎng)時(shí)間的浸潤(rùn)溶解從而將固體物質(zhì)在溶劑中的可溶物質(zhì)浸提出來(lái)；索氏提取法 (熱浸法)是利用溶劑回流及虹吸原理，使固體物質(zhì)被純?nèi)軇┏掷m(xù)提取，但在提取過(guò)程中大量雜質(zhì)會(huì)隨揮發(fā)性成分一起溶出，影響樣品分析結(jié)果，而且在提取過(guò)程中很難避免揮發(fā)性成分損失。

綜上所述，現(xiàn)有植物揮發(fā)性及半揮發(fā)性成分的提取方法均無(wú)法滿足艾葉中揮發(fā)性及半揮發(fā)性成分的準(zhǔn)確分析和客觀評(píng)價(jià)要求。為此，對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行改進(jìn)和對(duì)索氏提取的方法進(jìn)行改良后提取艾葉中的揮發(fā)性成分，以期為艾葉的揮發(fā)性及半揮發(fā)性成分提取提供快速、可靠的分析方法，并為其揮發(fā)性成分的質(zhì)量控制提供強(qiáng)技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 艾葉，購(gòu)于云南當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

1.1.2 儀器 高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司；Agilent 6890-5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司； ME414S型電子天平(感量0.000 1 g)，德國(guó)Sartorius公司； SJIA-5FE小型視頻冷凍干燥機(jī)，寧波雙嘉。

改良索氏提取裝置的部件：燒瓶1，燒瓶1上設(shè)有第1接口3、第2接口4和螺紋接口2，燒瓶1通過(guò)第1接口3與隔熱導(dǎo)氣管5氣流導(dǎo)通連接，隔熱導(dǎo)氣管5另一端與三通轉(zhuǎn)接管7氣流導(dǎo)通連接，三通轉(zhuǎn)接管7的另外2個(gè)接口分別與密閉冷凝管10和樣品筒8氣流導(dǎo)通連接，密閉冷凝管10上設(shè)有泄壓閥11，樣品筒8遠(yuǎn)離三通轉(zhuǎn)接管7的一端設(shè)有篩板12并與固相萃取柱9氣流導(dǎo)通連接，固相萃取柱9的另一端通過(guò)溶劑回流管6與第2接口4氣流導(dǎo)通連接，溶劑回流管6內(nèi)設(shè)有三通閥13(圖1)。

帶固相萃取功能的索氏提取裝置的工作過(guò)程：樣品分析時(shí)，于固相萃取柱9中加入硅膠顆粒，在樣品筒8中裝入稱量好的樣品，在樣品上方覆蓋1層無(wú)水硫酸鈉(用于除去溶劑及管道內(nèi)的水分)，將樣品筒8與固相萃取柱9密封連接，在燒瓶1中加入回流提取的溶劑(二氯甲烷)，將固相萃取柱9通過(guò)溶劑回流管6與第2接口4密封連接，將隔熱導(dǎo)氣管5與第1接口3密封連接，將三通轉(zhuǎn)接管7的3個(gè)接口分別與樣品筒8、密封冷凝管10和隔熱導(dǎo)氣管5密封連接，密封冷凝管10接通冷凝水，最后將燒瓶1置于水浴鍋或油浴鍋中加熱冷凝回流。樣品提取過(guò)程中，溶劑回流管6的三通閥13與第2接口4氣流導(dǎo)通，揮發(fā)的溶劑將固相萃取柱9中所提取的待測(cè)樣品回流至燒瓶1中，當(dāng)樣品提取完畢后，把三通閥13調(diào)整為與外界空氣導(dǎo)通的狀態(tài)，不斷揮發(fā)的溶劑通過(guò)三通閥13流出并回收，此時(shí)燒瓶1中的溶液不斷被濃縮直至溶劑蒸發(fā)完，即可進(jìn)行色譜檢測(cè)。

1.1.3 試劑 二氯甲烷(色譜純)，美國(guó)Dicma公司；柱色譜硅膠(200～300目)，青島海洋化工廠；無(wú)水硫酸鈉(AR)，天津化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 于固相萃取柱9內(nèi)填充20 g硅膠顆粒，然后稱取冷凍干燥并粉碎后的待測(cè)樣品5.0 g于樣品筒8中；將放置有樣品的樣品筒8與帶有固相萃取功能的索氏提取裝置的其他部分密封連接；于燒瓶1中加入200 mL二氯甲烷溶劑，然后將上述裝置放入水浴鍋中于50℃下加熱回流2.5 h。樣品提取完畢后，打開三通閥13，讓溶劑從溶劑回收口流出回收溶劑，直至燒瓶1尾管中的樣品溶液蒸發(fā)至約1 mL，濃縮好的樣品準(zhǔn)確定容到5.0 mL，用0.45 μm的針頭過(guò)濾器過(guò)濾，濾液進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.2 提取試劑的選擇 采用改良的帶固相萃取功能的索氏提取裝置提取艾葉樣品，分別用乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷 3種不同極性的溶劑提取，對(duì)比提取液的 GC-MS總離子流圖。

1.2.3 提取時(shí)間的優(yōu)化 按1.2.1的樣品前處理方法，采用改良的帶固相萃取功能的索氏提取裝置分別提取艾葉樣品1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，分析對(duì)比不同提取時(shí)間得到的提取液的 GC-MS總離子流圖。

1.2.4 固相萃取填料用量的選擇 索氏提取法在提取過(guò)程中大量雜質(zhì)會(huì)隨揮發(fā)性成分一起溶出，因此研究對(duì)傳統(tǒng)索氏提取裝置進(jìn)行改進(jìn)，于索氏提取裝置中增設(shè)了固相萃取柱，采用硅膠作為固相萃取填料以吸附提取液中的雜質(zhì)，并對(duì)硅膠的用量進(jìn)行了優(yōu)化。分別于改良的帶固相萃取功能的索氏提取裝置的固相萃取柱中放置10 g、20 g、30 g、40 g硅膠顆粒(30～60 μm)，分析對(duì)比提取液的 GC-MS總離子流圖。

1.2.5 色譜條件 DB-5 MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣量1.0 μL，柱流量1.0 mL/min，分流比為10∶1，進(jìn)樣口溫度260℃。程序升溫條件：初始溫度50℃，保持2 min；再以5℃/min 速率升至220℃；再以10℃/min速率升至250℃，保持10 min。

1.2.6 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源為E1；離子化電壓70 eV，離子源溫度230℃；傳輸線溫度280℃，質(zhì)量掃描范圍50～350 amu。

1.2.7 系統(tǒng)方法學(xué)考察

1) 重現(xiàn)性。從艾葉揮發(fā)性成分中含量最高的烯類化合物、醇類化合物和酮類化合物中選擇有代表性的石竹烯、4-萜烯醇和2-莰酮3種組分，在同一天內(nèi)平行測(cè)定7次，計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；相同樣品每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2) 檢出限。選擇不同揮發(fā)性的3種組分苯乙酮、石竹烯和棕櫚酸酯考察方法的檢出限。配制濃度為0.1 μg/mL的3種物質(zhì)的混合標(biāo)液，平行進(jìn)樣10次，以10次測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍計(jì)算得到3種物質(zhì)的的檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑

試驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷3種提取試劑中，二氯甲烷溶劑萃取到的化學(xué)成分種類最多，色譜峰面積較大，故選用二氯甲烷作為提取溶劑。

2.2 提取時(shí)間

試驗(yàn)表明，提取2 h后，總離子流圖中化學(xué)成分種類及色譜峰面積基本保持不變，為保證目標(biāo)物提取完全，試驗(yàn)選擇提取時(shí)間為2.5 h。

2.3 固相萃取填料用量

當(dāng)硅膠用量為10 g時(shí)，提取液總離子流圖中化學(xué)成分種類及色譜峰面積明顯小于其他3種硅膠用量；硅膠用量為20 g和30 g時(shí)，提取液總離子流圖中化學(xué)成分種類及色譜峰面積沒(méi)有明顯變化；硅膠用量為40 g時(shí)，提取液總離子流圖中化學(xué)成分種類及色譜峰面積略低于20 g和30 g的硅膠用量，可能是由于硅膠用量較大時(shí)吸附了部分揮發(fā)性成分。為實(shí)現(xiàn)提取液的有效凈化，選擇固相萃取填料的用量為20 g。

2.4 艾葉揮發(fā)性成分

從表1可知，艾葉的二氯甲烷提取物中共鑒定出 62種成分，主要包括烯類、醇類、酮類、醛類、有機(jī)酸等。其中，烯類化合物最多，為19 種，總含量為30.05%，含量較高的成分主要有石竹烯(5.94%)、3-蒈烯(3.96%)、反-β-法尼烯(3.18%)、[S-(R*，S*)]-3-(1，5-二甲基-4-己烯基)-6-亞甲基-環(huán)己烯(2.94%)、6，10-二甲基-3-(異丙基亞基)-1-環(huán)癸烯(2.74%)、(1R，3E，7E，11R)-1，5，5，8-四甲基-12-氧雜二環(huán)[9.1.0]十二-3，7-二烯(2.46%)和律草烯含量較高的成分主要有桉樹腦(2.75%)、(-)-桃金娘烯醇(2.31%)、(1R，7S，E)-7-異丙基-4，10-二亞甲基環(huán)癸-5-烯醇(2.04%)、4-萜烯醇(2.00%)和10，10-二甲基-2，6-二亞甲基二環(huán)[7.2.0]十一烷-5β-醇(1.99%)等；酮類化合物有7種，總含量為12.51%，含量較高的成分主要有2-莰酮(4.50%)、刺柏烯酮(2.31%)、3，3，6-三甲基-1，5-庚二烯-4-酮(1.99%)、3-甲基-6-異丙基-2-環(huán)己烯-1-酮(1.83%)、4-(1，5-二甲基己-4-烯基)環(huán)己-2-烯酮(1.76%)、D-香芹酮(1.42%)、4-羥基-3-甲基苯乙酮(1.25%)等；有機(jī)酸有3種，均為長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸；此外，還有少量酚類化合物 (3種)、醛類化合物(2種)、酯類化合物(1種)及其他化合物(10種)。

表1 艾葉提取物中的揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components in A. argyi extract

續(xù)表1

2.5 艾葉香味成分

從表2可知，艾葉提取物中有26種香味成分，占揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)質(zhì)量的 41.51%。其中，石竹烯被GB 2760-1996批準(zhǔn)為允許使用的食品香料，可用于調(diào)配丁香、胡椒、肉豆蔻、柑橘、藥草等食用香精，也可用于合成其他香料；2-莰酮具有樟木氣味，可用于配制薄荷、白檸檬和果仁等食品香精，以及配制花露水、日用化妝品等日用香精；桉樹腦(醇)具有與樟腦相似的氣味，可用于藥草型香精；3-蒈烯具有強(qiáng)烈的松木樣香氣，可用于多種食用香精中，亦可作合成香料的原料，這些香味成分協(xié)調(diào)配伍，賦予了艾葉特殊的香氣。

表2 艾葉提取物中的揮發(fā)性香味成分Table 2 Volatile aroma components in A. argyi extract

2.6 方法重現(xiàn)性和檢出限

從表3可知，4-萜烯醇的日內(nèi)和日間RSD分別為3.40%和3.72%；2-莰酮的日內(nèi)和日間RSD分別為3.53%和4.00%；石竹烯的日內(nèi)和日間RSD分別為3.14%和3.64%?？梢?jiàn)方法重現(xiàn)性較好。

表3 艾葉部分揮發(fā)性成分的日間與日內(nèi)重復(fù)性Table 3 Day-to-day and intra-day repeatability of some volatile components in A. argyi %

經(jīng)計(jì)算，苯乙酮、石竹烯和棕櫚酸酯的檢出限分別為0.140 μg/mL、0.210 μg/mL和0.130 μg/mL。說(shuō)明方法靈敏度較高。

3 結(jié)論與討論

研究設(shè)計(jì)的帶固相萃取功能的索氏提取裝置可在密閉條件下對(duì)樣品進(jìn)行分離、提純、濃縮，無(wú)需如傳統(tǒng)的分離提純、濃縮需要多次轉(zhuǎn)移、濃縮的操作步驟，大大提高了提取效率；此外，該裝置采用全封閉的冷凝管，有效避免提取溶劑的揮發(fā)損失，大大降低樣品前處理過(guò)程對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境造成的污染，密閉冷凝器帶有泄壓閥，壓力過(guò)高時(shí)可自動(dòng)泄壓，有效避免了可能因壓力過(guò)高對(duì)提取裝置造成的損壞；裝置在溶劑回流管中設(shè)置三通閥，通過(guò)切換閥門可直接切換樣品回流提取和濃縮，整個(gè)操作流程不需要轉(zhuǎn)移樣品；此外，裝置中還設(shè)計(jì)了連接色譜進(jìn)樣瓶接口的圓底燒瓶，樣品濃縮完成后，旋下色譜進(jìn)樣瓶即可直接進(jìn)行分析，避免了常規(guī)樣品尾管濃縮燒瓶濃縮完后需用吸管把尾管中溶液取出并洗滌尾管和吸管的步驟。進(jìn)一步簡(jiǎn)化了樣品前處理操作。

研究利用改良的帶固相萃取功能的索氏提取裝置提取艾葉中的揮發(fā)性成分，采用GC/MS 聯(lián)用技術(shù)分析鑒定出 62種揮發(fā)性組分，其中具有香味的成分有26 種。此外，艾葉提取物中的一些揮發(fā)性物質(zhì)還具有一定的藥用活性，如o-百里香素有防、殺昆蟲和殺真菌作用，其殺真菌活性比標(biāo)準(zhǔn)抗真菌抗生素更強(qiáng)；桉樹腦具有解熱、消炎、抗菌、防腐、平喘及鎮(zhèn)痛作用。艾葉揮發(fā)性成分與樟腦組成的復(fù)方臨床上可用于治療頭痛；2-莰酮可用作防蛀劑、防腐劑以及制造火藥、醫(yī)藥、香料、焰火等；冰片可用于目赤腫痛，喉痹口瘡、用于瘡瘍腫痛，潰后不斂等；(反)-β-法尼烯是蚜蟲的報(bào)警信息素，將(反)-β-法尼烯與常規(guī)殺蟲劑混用，將驅(qū)使蚜蟲主動(dòng)接觸殺蟲劑，在動(dòng)態(tài)中被滅殺；石竹素在醫(yī)學(xué)中用于治療病毒性遷延性慢性肝炎，對(duì)癥狀、體征和肝功能均有明顯的改善作用，也尚有糾正蛋白代謝障礙的作用。這些成分可用于香精、香料及制藥，具有很高的開發(fā)利用價(jià)值。