胡基華 李晶 曹旭 姜威 陳靜宇 孟利強(qiáng) 張淑梅

摘要：為了研究棚室黃瓜連作障礙，利用微生物菌劑改善連作產(chǎn)生的土壤問(wèn)題，將解淀粉芽孢桿菌TF28以液體（L）、顆粒（P）、復(fù)合（LP）3種形式施用，取苗期、花期、盛果期、結(jié)果后期土壤樣品，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)施用TF28與不施用TF28（CK）處理的土壤細(xì)菌多樣性、群落組成進(jìn)行比較分析，并對(duì)菌群代謝功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）為8個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門。Haliangium、Asanoa、Microvirga 3個(gè)屬與CK差異明顯。結(jié)果3種處理的菌群功能預(yù)測(cè)結(jié)果比CK好，其中P處理預(yù)測(cè)結(jié)果比其他2種處理好，對(duì)棚室連作黃瓜土壤調(diào)節(jié)穩(wěn)定。本研究為改善棚室連作黃瓜障礙，實(shí)現(xiàn)設(shè)施蔬菜持續(xù)穩(wěn)定健康生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：高通量測(cè)序;連作障礙;細(xì)菌豐度;代謝功能;施用方式

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）18-0262-07

收稿日期：2019-11-14

基金項(xiàng)目：黑龍江省院所基本應(yīng)用技術(shù)研究專項(xiàng)（編號(hào)：ZNBZ2018SW02）。

作者簡(jiǎn)介：胡基華（1970—），女，吉林長(zhǎng)春人，博士，副研究員，主要從事生物防治方面研究。E-mail：158631375@qq.com。

通信作者：張淑梅，博士，研究員，從事微生物藥物研究。E-mail：shumeizhang@Yahoo.com。

連作障礙備受關(guān)注[1]，研究表明土壤微生物區(qū)系改變是造成作物連作障礙的重要因素之一[2]。在東北地區(qū)，黃瓜（Cucumis sativas L.）是設(shè)施蔬菜的主要栽培種類，1年可多茬栽種，農(nóng)民為了經(jīng)濟(jì)效益盲目增加肥料投放量，更加劇了土壤營(yíng)養(yǎng)失衡。土壤產(chǎn)出率雖高，但得不到修復(fù)、連年惡化，隨著時(shí)間積累作物生理病害日益嚴(yán)重，產(chǎn)量和品質(zhì)也隨之下降[3-5]。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，可以提高土壤肥力、維持土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)的良性循環(huán)，一定程度上抑制作物土傳病害[6]。微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富，多樣性越高，對(duì)抗病原菌的綜合能力越強(qiáng)[7]。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）在自然界中分布廣泛，是一類重要的生防資源菌，具有較高開發(fā)價(jià)值[8-9]，在植物病害生物防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens） TF28是從大豆根部分離出的1株內(nèi)生細(xì)菌，具有廣譜抗菌活性[11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，它可以改善棚室連作土壤的pH值，增加土壤細(xì)菌、放線菌生物量，降低真菌生物量，同時(shí)對(duì)磷酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶具有調(diào)節(jié)作用;對(duì)黃瓜的根系發(fā)育具有促進(jìn)作用[12]。本研究基于前期試驗(yàn)結(jié)果，選取苗期、花期、結(jié)果期和結(jié)果后期土壤樣品，采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)棚室連作黃瓜根跡土壤細(xì)菌群落豐度動(dòng)態(tài)變化和菌群功能進(jìn)行研究預(yù)測(cè)，以期為微生物改善連作障礙、改良土壤健康狀況提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

試驗(yàn)所用菌株由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。試驗(yàn)地點(diǎn)：黑龍江省哈爾濱市太平鎮(zhèn)興業(yè)村。2018年2月穴盤育苗，4月5日棚室移載;菌液濃度為108 CFU/mL，顆粒劑含菌量為2×108～3×108 CFU/g。菌劑施用方法：（1）液體樣品（L）施用法：移栽時(shí)在苗根部澆施 5 mL（108 CFU/mL）/顆;（2）顆粒劑（P）施用法，瓜苗移栽前穴施5 g（2×108～3×108 CFU/g）/顆;（3）復(fù)合[LP（菌液+顆粒劑）]施用法：移栽時(shí)穴施5 g（2×108～3×108 CFU/g）/顆，移栽后澆施菌懸液 5 mL（108 CFU/mL）/顆。以不施用TF28的處理為空白對(duì)照（CK）。日光溫度南北跨度50 m，東西跨度 7 m，黃瓜種植行距50 cm，株距35 cm。按周取樣，采用五點(diǎn)取樣法取根際5～10 cm處土壤，混合過(guò) 2 mm 篩，于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2?土壤微生物基因組DNA提取

根據(jù)前期TF28對(duì)黃瓜的生育指標(biāo)、pH值、酶（磷酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶）活性的試驗(yàn)結(jié)果[12]，選用苗期（第2～3周）、花期（第4周）、盛果期（第6～7周）、結(jié)果后期（第10周）6個(gè)時(shí)間段的24組樣品，送至上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行DNA提取和高通量測(cè)序。使用OMEGA土壤試劑盒（D5625-01）提取細(xì)菌總基因組DNA樣本，-20 ℃ 存儲(chǔ)。分別用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)）和瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定DNA的提取量和質(zhì)量。

1.3?聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增及高能量測(cè)序

提取的DNA以v3和v4為目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）及806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），擴(kuò)增產(chǎn)物在Illumina Miseq平臺(tái)上進(jìn)行高能量測(cè)序。

1.4?對(duì)根際土壤細(xì)菌群落的分析

對(duì)Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，去除低質(zhì)量序列（長(zhǎng)度<150 bp、測(cè)序堿基質(zhì)量值<20的序列，即模糊堿基和單核苷酸重復(fù)>8 bp 的序列），得到優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行下游分析。在嵌合體檢測(cè)之后采用UCLUST軟件以97%相似度進(jìn)行操作分類單元（OTU）劃分，按豐度高低使用QIIME軟件構(gòu)建稀釋性曲線。通過(guò)Galaxy在線分析平臺(tái)進(jìn)行LEfSe分析，對(duì)樣本（組）間進(jìn)行分類學(xué)組成的差異分析。使用Mothur軟件，調(diào)用Metastats（http：//metastats.cbcb.umd.edu/）的統(tǒng)計(jì)學(xué)算法，對(duì)門、屬水平的各分類單元在樣本（組）間的序列量（即絕對(duì)豐度）差異進(jìn)行兩兩比較。菌群代謝功能使用PICRUST預(yù)測(cè)工具，將現(xiàn)有的16S rRNA基因測(cè)序數(shù)據(jù)與代謝功能已知的微生物參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)相對(duì)比，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌和古菌代謝功能的預(yù)測(cè)，根據(jù)不同物種16S rRNA基因拷貝數(shù)的差異，對(duì)原始數(shù)據(jù)中的物種豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。

1.5?數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用ANOVA單因素（LSD法）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P<0.05）。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同處理土壤微生物群落豐度及多樣性

3種處理6個(gè)時(shí)間點(diǎn)共計(jì)24個(gè)樣本，共獲得804 159條高質(zhì)量的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列。土壤細(xì)菌覆蓋度（coverage）指數(shù)為0.909 8～1.000，測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序數(shù)據(jù)基本涵蓋棚室連作黃瓜土壤中所有細(xì)菌類群，能體現(xiàn)土壤環(huán)境中細(xì)菌特征。按97%的序列相似度進(jìn)行歸并共產(chǎn)生10 398個(gè)OTU，L、P、LP和CK所特有的OTU數(shù)量分別為679、773、717、713（圖1-a）。多樣性Simpson和Shannon指數(shù)第4周P處理均為最高，分別為 0998 619 和10.50（表1）;豐富度Chao1和ACE指數(shù)在第6周P處理有最高值，分別為4 043.64和 4 172.24;可視物種在第2周LP處理顯示為最高值3 044.00。

2.2?不同處理棚室連作黃瓜土壤細(xì)菌群落組成

根據(jù)獲得的OTU豐度矩陣，使用R軟件計(jì)算各樣本（組）獨(dú)有及共有OTU數(shù)量，L、P、LP和CK的OTU分別為679、773、717和713（圖1-a）。OTU共注釋到31個(gè)門，106個(gè)綱，218個(gè)目，424科，1 008個(gè)屬和1 769個(gè)種。門水平豐度前20用柱形標(biāo)示（圖1-b），其中大于1%的有8個(gè)，分別是變形菌門（Proteobacteria，43.52%）、放線菌門（Actinobacteria，25.80%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，7.19%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，7.00%）、綠彎菌門（Chloroflexi，632%）、酸桿菌門（Acidobacteria，438%）、厚壁菌門（Firmicutes，1.89%）、螺旋體菌門（Saccharibacteria，1.85%），變形菌門為主要優(yōu)勢(shì)菌類群。1 008個(gè)屬豐度高于1%有17個(gè)，其中4個(gè)為變形菌門，3個(gè)為放線菌門、綠彎菌門和擬桿菌門，芽單胞菌門、放線菌門、螺旋體菌門和厚壁菌門各有1個(gè)。

2.3?不同處理樣本間差異分析

表2顯示，門水平兩兩比較發(fā)現(xiàn)P-CK中綠菌門（Chlorobi）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、酸桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門這5個(gè)具有差異性;L和CK兩兩比較中酸桿菌門具有差異性（表3）。屬水平比較中，P和CK具有差異性的樣本（組）共有44個(gè)（表2、表4），L和CK有28個(gè)，LP和CK有15個(gè)。屬水平樣本（組）間差異最顯著的前20個(gè)分類單元的豐度分布情況用小提琴圖標(biāo)示（圖2），其中Asanoa、Georgenia、Microvirga的3個(gè)處理與CK差異最為明顯。

2.4?菌群代謝功能預(yù)測(cè)

根據(jù)PICRUST預(yù)測(cè)結(jié)果，共有功能類群數(shù)量為5 757（圖3-a）;兩兩重疊部分?jǐn)?shù)量分別是3（L/CK）、6（L/LP）、8（LP/P）、14（L/P）、7（P/CK）、7（LP/CK）;三重疊部分?jǐn)?shù)量分別為12（CK/L/LP）、44（L/LP/P）、7（CK/L/P）;L、LP、P和CK獨(dú)有功能菌群數(shù)量分別是21、58、16和5。如高豐度前50位的功能類群聚類分析繪制熱圖（圖3-b）所示，將兩大區(qū)塊按豐度高低再分為4個(gè)區(qū)塊（圖3-b黃線分割）。在10個(gè)高豐度功能類群中，3個(gè)處理組各有3個(gè)，CK有1個(gè);在14個(gè)低豐度樣品中，3個(gè)處理組各有3個(gè)，CK有5個(gè)。P處理6個(gè)時(shí)間段分別在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區(qū)，4個(gè)區(qū)均有L、LP處理。部分類群功能見(jiàn)表5。

3?討論與結(jié)論

微生物在土壤有機(jī)質(zhì)形成和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化循環(huán)中有重要作用[13]，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性、活性是影響連作障礙的主要因素[14]，同時(shí)也是維持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性和可持續(xù)性的重要保證。設(shè)施蔬菜連作會(huì)導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)單一、有害微生物數(shù)量增多[15]。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens） TF28能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，具有廣譜抑制植物病原真菌的功能[16]。本研究結(jié)果顯示，3種處理在苗期、花期、盛果期、結(jié)果后期土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)差異不大，連作并未造成土壤菌群生物量大量減少，菌群構(gòu)成較穩(wěn)定。但是在花期、盛果期，土壤微生物相對(duì)豐度存在較大差異，這與前人研究結(jié)果[17-19]相似。P處理在第4周（花期）和第6周（盛果期）多樣性指數(shù)與豐富度指數(shù)達(dá)到最高值，明顯高于其他2種處理和空白對(duì)照，根際微生物主要類群的數(shù)量與其生長(zhǎng)發(fā)育呈正相關(guān)關(guān)系，這與前人研究結(jié)果[20]一致。土壤細(xì)菌群落組成結(jié)果表明，變形菌門為優(yōu)勢(shì)類群、其次為放線菌門和芽單胞菌門，連作會(huì)造成土壤微生物選擇性的適應(yīng)，造成某些種群富集，而另一些種群數(shù)量降低的現(xiàn)象[17]。與CK相比，P處理提高硝化螺旋菌門微生物量，硝化螺旋菌門具有固氮作用和良好的根際效應(yīng)，相關(guān)結(jié)論有待后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。酸桿菌門是L和P處理與CK共同差異菌門，特別是P處理酸桿菌門OTU相對(duì)豐度比CK提高60.4%，顯示了明顯的調(diào)節(jié)作用;已有的研究表明酸桿菌廣泛存在于自然界的各種環(huán)境中，占土壤細(xì)菌類群的5%～46%或者超過(guò)50%[21-22]，大多為嗜酸菌，對(duì)土壤pH值極為敏感[23]。3種處理對(duì)Haliangium、Acidibacter、Microvirga具有明顯的調(diào)節(jié)作用（表4、圖3），Haliangium為一種中度嗜鹽菌群[24]，Acidibacter為一種嗜酸鐵離子還原菌[25]，Microvirga具有明顯的溶大腸桿菌活性，抑制馬鈴薯晚疫病菌活性[26]。菌群代謝功能預(yù)測(cè)L、LP、P特有數(shù)量均比CK高;三重疊部分?jǐn)?shù)量CK與L、LP組和L、P組數(shù)量分別是12和7，而L、LP、P重疊部分?jǐn)?shù)量為44，差異明顯，2組數(shù)據(jù)說(shuō)明3種處理與空白對(duì)照相似度小，對(duì)土壤微生物的功能作用高于空白對(duì)照。LP2、L10、CK10 3個(gè)時(shí)間段在Ⅰ區(qū)功能類群豐度值相對(duì)較高，這可能是苗期土壤微生物代謝功能健康，結(jié)果后期植株需要養(yǎng)分較少，同時(shí)土壤具有自我修復(fù)能力的表現(xiàn)。菌群代謝功能結(jié)果顯示，TF28提高了連作土壤整體細(xì)菌群系的功能包括生物降解和代謝、類萜化合物和聚脂化合物的代謝、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、多糖和單糖生物合成和代謝等，代謝功能作用將在后續(xù)工作中繼續(xù)研究證實(shí)。

本研究結(jié)果說(shuō)明，解淀粉芽孢桿菌TF28對(duì)棚室連作黃瓜根際土壤具有改善作用，3種處理對(duì)土壤微生物細(xì)菌群落豐度及多樣性與CK無(wú)明顯差異，對(duì)連作黃瓜土壤中細(xì)菌群落組成與CK差異明顯。TF28對(duì)棚室連作黃瓜土壤具有一定的調(diào)節(jié)修復(fù)作用，P處理與L和LP相比表現(xiàn)出良好的根際效應(yīng)和穩(wěn)定的改善作用。

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