徐晗 閆晗 褚晉 繆建錕 楊皓 白元俊 董海

摘要：從源于2個地區(qū)種植的遼粳401自然發(fā)病的8穗稻曲病穗的8個稻曲球中分離獲得15株稻曲病菌（Ustilaginoidea virens），其中從2個稻曲球的不同部位共分離獲得8株稻曲病菌。用人工注射接種法將菌株分別接種到水稻品種豐田一號（感病品種）和遼粳401（中抗品種）上。結(jié)果表明，分離的菌株致病力分化較大。不同地區(qū)種植的同一寄主品種菌株致病力有差異;同一稻曲球上分離的菌株表現(xiàn)出致病力差異;同一菌株接種不同水稻品種，株發(fā)病率主要與水稻抗性有關(guān)。為提高稻曲病病菌接種成功率，對接種稻曲病病菌的水稻進(jìn)行不同梯度的溫度和保濕時間處理。結(jié)果表明，低溫處理有利于提高稻曲病病菌的接種成功率。

關(guān)鍵詞：稻曲病菌;致病力分化;接種處理條件;真菌

中圖分類號： S435.111.4+6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0128-04

收稿日期：2019-10-29

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2017YFD0300709-A05）。

作者簡介：徐?晗（1989—），女，遼寧本溪人，碩士，助理研究員，主要從事水稻真菌性病害病原學(xué)及防治技術(shù)研究。E-mail：xuhan1989@126.com。

通信作者：董?海，碩士，研究員，主要從事水稻病害研究。E-mail：lnsydh@163.com。

水稻稻曲病（rise false smut）是由稻綠核菌[Ustilaginoidea virens （Coole） Takahashi]侵染引起的水稻穗部真菌性病害。稻曲病的發(fā)生會造成稻穗空秕率增加，水稻產(chǎn)量下降;同時，稻曲球含有的稻曲菌毒素可以引起人畜病變[1]。稻曲病病害嚴(yán)重時，發(fā)病率高達(dá)44.1%，產(chǎn)量損失高達(dá)26.9%[2]。因此，控制稻曲病的發(fā)生發(fā)展，對水稻生產(chǎn)至關(guān)重要。

目前，學(xué)者們對稻曲病病菌的侵染過程已做了大量研究，普通觀點認(rèn)為，稻曲病病菌以菌核和厚垣孢子的形式在田間病殘體、土壤或者其他寄主植物上越冬，翌年在合適條件下萌發(fā)侵染水稻。張震等研究推測，稻曲病病菌侵染水稻雌蕊發(fā)生在水稻開花以前，可直接從子房上獲得營養(yǎng)形成稻曲球[3]。研究稻曲病病菌的致病力分化，有助于病害流行預(yù)測和抗病品種的選育，同時也是綜合防控稻曲病的基礎(chǔ)性工作[4]。但迄今為止，有關(guān)稻曲病病菌致病性分化的研究鮮有報道。

人工接種技術(shù)是為探索稻曲病病菌侵染過程、致病力分化、寄主的抗病機(jī)制及抗病育種等過程不可逾越的一步，目前稻曲病病菌人工接種方法還不夠成熟。張君成等報道用馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（potato-saccharose，簡稱PS）液體培養(yǎng)獲得的菌絲片段和分生孢子混合液于16：00—18：00注射接種抽穗破口前6～9 d的水稻，接種效果最好[5-6]。但對于接種后不同梯度的溫度和保濕時間對稻曲病病菌接種發(fā)病率的影響報道較少。為此，本試驗對稻曲病病菌接種不同品種后條件的處理進(jìn)行比較研究，以明確接種后不同溫度和保濕時間對稻曲病發(fā)生的影響。

1?材料與方法

接種試驗于2019年8月5日在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院盆栽場試驗基地進(jìn)行，2019年9月9日調(diào)查接種結(jié)果。室內(nèi)試驗于2018年5月至8月在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所進(jìn)行。

1.1?供試材料

1.1.1?菌株

2018年采集于遼寧省沈陽與東港2個地區(qū)種植的遼粳401自然發(fā)病的稻曲病標(biāo)樣。

1.1.2?培養(yǎng)基成分

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（potato-saccharose-agar，簡稱PSA）：200 g馬鈴薯、20 g蔗糖、20 g瓊脂，加水至1 L。PS：200 g馬鈴薯、20 g 蔗糖，加水至1 L。

1.1.3?接種水稻品種

遼粳401由遼寧省水稻研究所提供。豐田一號由遼寧省鹽堿地利用研究所提供。

1.2?方法

1.2.1?供試菌株的分離與培養(yǎng)

采用厚垣孢子懸液法，從稻曲球中分離菌株，并將上述分離菌株進(jìn)行單孢純化。提取菌株DNA，按照Zhou等方法[7]對菌株進(jìn)行分子鑒定。純化菌株在濾紙片上于 -20 ℃ 條件下保存。

1.2.2?水稻的種植和接種體的制備

水稻的種植：將水稻種子消毒后進(jìn)行育苗，種植于育秧盤中。待生長到四葉期插秧于草炭土和黃土1 ∶1的盆中，每盆4點，每點2棵苗，常規(guī)栽培管理。

接種體的制備：將濾紙片上活化的稻曲病病菌移入PS培養(yǎng)基中，27 ℃，130 r/min振蕩培養(yǎng)，7 d后可獲得大量菌絲和薄壁分生孢子。

1.2.3?接種方法

在水稻孕穗期，即在水稻破口抽穗前7 d，用注射器將菌絲-分生孢子接種液（1×106個/mL）從側(cè)面注入稻苞直至充滿溢出（每穗1～2 mL）。每盆設(shè)無菌水注射作空白對照。每個菌株接種水稻10～20株。作溫濕度處理的水稻使用混合菌株接種50株。

1.2.4?各接種條件的不同設(shè)置

接種后盆栽分別置于（15±1）、（20±1）、（25±1） ℃的人工氣候室中，相對濕度為（95±5）%、光—暗為12 h—12 h交替培養(yǎng)。在保濕48、72、96 h后，分別將水稻移至室外繼續(xù)培養(yǎng)。于傍晚（16：00—18：00）盆栽注射接種后，室外常規(guī)培養(yǎng)作為對照組。

1.2.5?病情調(diào)查統(tǒng)計方法

接種21 d后調(diào)查接種結(jié)果，記錄水稻病穗數(shù)及每穗病粒數(shù)。參考前人研究的分級標(biāo)準(zhǔn)[8-9]，結(jié)果見表1，將病級分為11級。病情指數(shù)計算公式：病情指數(shù)=∑（各級病穗數(shù)×相應(yīng)的級數(shù)）/（調(diào)查總穗數(shù)×最大病級數(shù)）×100。

2?結(jié)果與分析

從田間采集的稻曲病標(biāo)樣上采用徐晗等的厚垣孢子液法[10]，分離出15株稻曲病單孢菌株。其中東港市分離出4株菌株，沈陽市分離出11株菌株（表2）。沈陽市的S①-1～S①-5來源于同一稻曲球（1號球）的不同部位，S②-1～S②-7來源于另一稻曲球（2號球）的不同部位。為保證供試菌株的可靠性，對分離菌株的菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)等進(jìn)行形狀觀察，發(fā)現(xiàn)供試菌株與筆者所在實驗室保存的其他稻曲病病菌菌株相似。進(jìn)一步提取分離的病原菌DNA，采用對稻曲病病菌特異的監(jiān)測引物進(jìn)行分子鑒定，所有分離菌株均在約380 bp處出現(xiàn)目的條帶，以此判斷分離菌株均為稻曲病菌（圖1）。

2.1?不同地區(qū)種植的同一寄主品種的分離菌株致病力分析

選取2個采集地共8株菌株，接種同一水稻品種豐田一號，每個菌株注射接種20株孕穗期水稻，接種結(jié)果見表3。通過調(diào)查計算發(fā)病率和病情指數(shù)，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)種植的同一寄主品種分離的菌株致病力存在差異，東港地區(qū)菌株接種株發(fā)病率和病情指數(shù)最大值分別為45%、15，最小值分別為5%、1，平均值為20%、7;沈陽地區(qū)菌株接種株發(fā)病率和病情指數(shù)最大值分別為75%、38，最小值分別為20%、7，平均值為48%、18。表明菌株致病力分化可能與地域有很大關(guān)系。

2.2?同一稻曲球來源的不同菌株的致病力分析

選取來源于2個稻曲球的共8株菌株，分別接種同一水稻品種豐田一號，每個菌株注射接種10株孕穗期水稻，接種結(jié)果見表4。從同一稻曲球上分離的稻曲病病菌，接種水稻后仍表現(xiàn)出比較大的致病力差異。以從8號病穗上分離的5個稻曲病病菌為例，病情指數(shù)最大值為32，最小值為7，平均值為16。

2.3?同一菌株接種不同水稻品種的致病力分析

選取8個菌株，分別接種豐田一號和遼粳401，每個菌株注射接種孕穗期水稻，接種結(jié)果見表5，空白對照均未發(fā)病。對8個菌株的株發(fā)病率和病情指數(shù)作均值處理后，2個水稻品種的病情指數(shù)一致，但“田一號的株發(fā)病率高于遼粳401。接種菌株是從遼粳401上分離得到，而接種結(jié)果表明，菌株分離寄主接種結(jié)果并不顯示出特殊性，接種結(jié)果主要與水稻抗性有關(guān)。

2.4?接種后不同溫濕度條件對穗發(fā)病率與病情指數(shù)的影響

由表6可以看出，在保濕時間相同的條件下，低溫處理有利于提高發(fā)病率和病情指數(shù)，提高接種成功率。而在相同溫度處理下，保濕時間的延長，對接種結(jié)果影響不大。15 ℃處理組和20 ℃處理組接種結(jié)果均高于室外對照組;但25 ℃處理組接種結(jié)果與室外對照組相差不大。

3?結(jié)論與討論

本研究利用2018年采集的稻曲病樣，分離出15株單孢菌株，通過形態(tài)觀察和分子特異性引物檢測，確認(rèn)這15株單孢菌株均為稻曲病菌株。將15株菌株進(jìn)行水稻孕穗期注射接種，結(jié)果表明，不同地區(qū)種植的同一寄主品種分離出的菌株存在致病力差異，說明菌株致病力與地域有關(guān);對來源于同一稻曲球不同部位分離菌株的接種結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株存在較大的致病力差異;同一菌株對不同水稻品種接種結(jié)果表明，株發(fā)病率與水稻抗性有較大相關(guān)性。

已有研究報道表明，在同一個稻瘟病病斑上，存在不同類型的稻瘟病病菌小種類型，這種現(xiàn)象可能來源于生理小種的變異， 或是由不同菌株同時侵染造成的[11-12]。本研究表明，來源于同一稻曲球的菌株存在致病力分化，并且后期調(diào)查結(jié)果證明，菌株S②-1接種豐田一號在8月末稻曲球上有菌核產(chǎn)生，而S②-2～S②-7沒有菌核產(chǎn)生;而菌株 S②-1 接種遼粳401沒有產(chǎn)生菌核。目前菌核的產(chǎn)生機(jī)制尚不明確，還需大量試驗研究。

稻曲病病菌的人工接種技術(shù)是深入研究稻曲病的瓶頸，因此有必要探索高效引發(fā)稻曲病的接種技術(shù)。前人已對不同接種體的接種效果和接種時間進(jìn)行了深入探討[13]，注射接種孕穗期水稻，是目前比較常見的稻曲病病菌接種方法，在試驗過程中，筆者也嘗試用噴霧接種、棉花團(tuán)蘸取菌懸液保濕處理等方法，但均未能接種成功。為提高稻曲病病菌的接種成功率，筆者對注射接種的水稻進(jìn)行不同溫度、不同保濕時間的處理進(jìn)行探索。試驗結(jié)果表明，對于注射接種的水稻進(jìn)行低溫處理可以提高稻曲病病菌的接種成功率。15、20 ℃溫度處理組接種株成功率和病情指數(shù)要高于室外條件接種成功率，但 25 ℃ 處理接種成功率與室外對照組相差不大，甚至略低于室外對照組，這可能是因為室外對照組8月夜間溫度在20 ℃左右，對于接種算是一個短暫的低溫處理。接種后處理條件的改變可以導(dǎo)致接種結(jié)果的變化，因此接種后條件的處理也是影響稻曲病病菌接種成功率的一個重要因素。試驗初步認(rèn)為，低溫處理有利于提高稻曲病病菌的接種成功率。

全部試驗均在盆栽條件下進(jìn)行，每盆注射無菌水作為空白對照，對照均未發(fā)病，因此可以認(rèn)為發(fā)病是由人工接種引起的。接種后不同處理試驗采用混合菌株注射接種，以排除菌株致病力差異引起的接種效果不同。

參考文獻(xiàn)：

[1]Koiso Y，Yin L，Iwasaki S，et al. Ustiloxins，antimitotic cydic peptides from false smut balls on rice panicles caused by Ustilaginoidea virens[J]. The Journal of Antibiotics，1994，47（7）：765-773.

[2]Baruah B P，Senapotu D，Ali M S. False smut：a threat to rice growers in Assam[J]. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology，1992，22（3）：274-277.

[3]張?震，葉勝海，柴榮耀，等. 基于稻曲球機(jī)構(gòu)分析稻曲菌的侵染部位和侵染時期[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，22（2）：207-210.

[4]尹小樂，陳志誼，于俊杰，等. 江蘇省水稻區(qū)域試驗品種對稻曲病的抗性評價及稻曲病菌致病力分化研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，27（4）：1459-1465.

[5]張君成，陳志誼，張炳欣，等. 稻曲病的接種技術(shù)研究[J]. 植物病理學(xué)報，2004，34（5）：463-467.

[6]繆巧明，王永華. 水稻品種對稻曲病的抗病性鑒定技術(shù)研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，1994，7（2）：67.

[7]Zhou Y L. Specific and sensitive detection of the fungal pathogen Ustilaginoidea virens by nested PCR[J]. Mycosystema，2004，23（1）：102-108.

[8]唐春生，高家樟，曹國平，等. 稻曲病病情分級標(biāo)準(zhǔn)的研究和應(yīng)用[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2000，26（2）：122-125.

[9]李小娟，劉二明，肖啟明，等. 水稻對稻曲病抗性的分級及相應(yīng)級別的產(chǎn)量損失[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，37（3）：275-279.

[10]徐?晗，白元俊，繆建錕，等. 不同儲存時期稻曲病菌分離方法的比較[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017，39（5）：524-526.

[11]黃?富，涂建華. 稻瘟病菌致病性變異研究[J]. 水稻高梁科技，1997（2）：26-29.

[12]周益軍，程兆榜，范永堅，等. 田間水稻單個病斑中稻瘟病菌的遺傳多樣性[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，2003，30（4）：337-342.

[13]周永力，樊金娟，曾超珍，等. 稻曲病菌遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)的初步分析[J]. 植物病理學(xué)報，2004，34（5）：442-448.