石盼盼 謝文佳 劉燕 王璐 陳蕾 郝莉花

摘要：采用多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，對(duì)大豆篩選基因35S啟動(dòng)子（cauliflower mosaic virus，CaMV 35S）、NOS終止子（nopaline synthase，NOS）和內(nèi)源基因Lectin設(shè)計(jì)合成了多對(duì)檢測(cè)引物和探針，在篩選各基因合適的檢測(cè)引物和探針的基礎(chǔ)上，摸索引物組合和擴(kuò)增條件，最終確定合適的探針引物組合和試驗(yàn)條件，建立轉(zhuǎn)基因大豆快速初篩技術(shù)。該方法可在1 h內(nèi)同時(shí)完成對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆3個(gè)基因片段的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，可用于大豆轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測(cè)，大大提高檢驗(yàn)效率，可為消費(fèi)者的食品安全及我國大豆的進(jìn)出口檢驗(yàn)提供有效的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：三重實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR;大豆;轉(zhuǎn)基因成分;特異性;靈敏度

中圖分類號(hào)：S565.101?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）18-0077-04

收稿日期：2019-11-12

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)計(jì)劃（編號(hào)：172102310724）。

作者簡(jiǎn)介：石盼盼（1987—），女，河南洛陽人，碩士，工程師，主要從事食品安全質(zhì)量檢測(cè)研究。E-mail：523150920@qq.com。

大豆?fàn)I養(yǎng)豐富，為人類提供優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)和油脂，是我國重要的糧食油料兼用作物，也是重要的飼料來源[1-2]。我國大豆及相關(guān)產(chǎn)品的消費(fèi)量在國際上一直名列前茅。以2017年為例，我國消費(fèi)大豆油1 740萬t，占全球消費(fèi)總量的309%;消費(fèi)豆粕7 407萬t，占全球消費(fèi)總量的317%。隨著健康飲食方式的引導(dǎo)，大豆消費(fèi)水平不斷上升，但國內(nèi)種植量增長(zhǎng)緩慢。近幾年來，我國主要從美國、阿根廷等國家進(jìn)口大豆[3-4]。在進(jìn)出口貿(mào)易中大豆及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分是常檢項(xiàng)目。轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品因其安全性備受爭(zhēng)議，嚴(yán)重影響了人們對(duì)大豆的消費(fèi)熱情。目前，市場(chǎng)監(jiān)督管理及進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫部門著重于研究開發(fā)更為科學(xué)高效的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)技術(shù)，保證非批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因大豆及其產(chǎn)品無法進(jìn)入我國[5]。

我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已經(jīng)批準(zhǔn)美國孟山都等公司的多種轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)口到我國。我國自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因大豆品種也已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。我國轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的發(fā)展進(jìn)一步促使基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展升級(jí)[6]。目前我國國家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)主要以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法為主。如《農(nóng)業(yè)部2630號(hào)公告-15-2017轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種定性PCR方法》[7]和國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 33526—2017《轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品?數(shù)字PCR檢測(cè)方法》[8]。在研究領(lǐng)域多種基于分子生物學(xué)的檢測(cè)技術(shù)不斷涌現(xiàn)，但應(yīng)用性方面還有待研究推廣[9-14]。其中，魏霜等利用多重串聯(lián)式PCR基因碟片技術(shù)用于轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的檢測(cè)[15]，即利用多重PCR和巢式熒光定量PCR檢測(cè)GTS 40-3-2的多個(gè)外源基因和內(nèi)源基因，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因的高通量檢測(cè)，但該方法技術(shù)要求高，且檢測(cè)方法主要是普通PCR技術(shù)，檢測(cè)結(jié)果須要進(jìn)一步凝膠電泳分析，過程相對(duì)復(fù)雜。本試驗(yàn)研發(fā)的三重實(shí)時(shí)熒光PCR法可以達(dá)到多項(xiàng)國家標(biāo)準(zhǔn)和進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的基因檢測(cè)限，并且1次反應(yīng)能同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)有無轉(zhuǎn)基因大豆的CaMV 35S、NOS和Lectin 3個(gè)基因片斷，試驗(yàn)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，方便技術(shù)推廣應(yīng)用。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料與試劑

大豆轉(zhuǎn)基因成分陽性質(zhì)控樣品、大豆轉(zhuǎn)基因成分陰性質(zhì)控樣品，均購自中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心;實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增引物和探針（表1），均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;苯酚-三氯甲烷-異戊醇混合液（體積比為25 ∶24 ∶1）、2×PCR MasterMix，均購自北京索萊寶科技有限公司;試驗(yàn)用水取自筆者所在實(shí)驗(yàn)室 Milli-Q 超純水系統(tǒng)的二級(jí)水;其他無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2?儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水系統(tǒng)，購自密理博中國有限公司;HFsafe生物安全柜，購自上海力申科學(xué)儀器有限公司;LightCycle480熒光PCR儀，購自羅氏診斷產(chǎn)品有限公司;Colibri Titertek Berthold超微量分光光度計(jì)，購自上?？迫鹕锟萍加邢薰?移液器，購自美國Eppendorf公司;高通量組織研磨器，購自寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3?試驗(yàn)方法

1.3.1?基因組DNA的提取

酚三氯甲烷抽提法：稱取50 mg粉狀樣品至1.5 mL離心管中，加入 700 μL DNA提取裂解液，置65 ℃水浴3 h，其間不時(shí)振蕩混勻;12 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清至新的 1.5 mL 離心管中，加入等體積苯酚-三氯甲烷-異戊醇混合液（25 ∶24 ∶1），充分混勻后，12 000 r/min 離心5 min;取上清，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉溶液，混勻后加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，-20 ℃靜置3 h，12 000 r/min離心5 min棄去上清;加70%乙醇洗滌1～2次，通風(fēng)柜內(nèi)室溫下晾干，加50 μL TE緩沖液，最終獲得D260 nm/D280 nm在1.8～2.0之間的DNA溶液。

1.3.2?引物和探針的設(shè)計(jì)

在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫查找并拷貝轉(zhuǎn)基因大豆常用外源基因CaMV 35S啟動(dòng)子/NOS終止子及內(nèi)源基因Lectin的序列，使用NCBI的在線引物設(shè)計(jì)功能和生工生物工程（上海）股份有限公司的引物通過在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出針對(duì)這3個(gè)基因的正向引物、反向引物和熒光探針。分別使用熒光基團(tuán)FAM、Cy5和HEX作為發(fā)光基團(tuán)，使用TAMRA、BHQ3和TAMRA作為淬滅基團(tuán)。設(shè)計(jì)的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3?引物及探針特異性測(cè)試試驗(yàn)

分別用以轉(zhuǎn)基因大豆陽性質(zhì)控樣品及陰性質(zhì)控樣品的DNA為模板，按照以下反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)：滅菌蒸餾水 3.4 μL、2×PCR Master Mix 10 μL、正向引物（1 μmol/L）1.8 μL、反向引物（1 μmol/L）1.8 μL，探針（0.25 μmol/L）2 μL、DNA模板（50 ng/μL）1 μL，總體系20 μL。反應(yīng)程序：50 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，變性延伸過程進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。退火結(jié)束時(shí)采集探針對(duì)應(yīng)的單重?zé)晒?，進(jìn)行單重實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)，檢測(cè)3個(gè)基因?qū)?yīng)的引物及探針的特異性。每個(gè)基因擴(kuò)增設(shè)置陽性樣品、陰性樣品、空白對(duì)照，各設(shè)2個(gè)重復(fù)。陽性試驗(yàn)以轉(zhuǎn)基因大豆陽性質(zhì)控樣品DNA為模板，陰性試驗(yàn)以轉(zhuǎn)基因大豆陰性質(zhì)控樣品DNA為模板，空白對(duì)照以無菌水作為擴(kuò)增模板。

1.3.4?三重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系及程序

在各基因單重PCR檢測(cè)對(duì)應(yīng)引物探針特異性良好的基礎(chǔ)上，摸索合適的引物配比和試驗(yàn)條件，進(jìn)行三重實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)，最終三重?zé)晒釶CR檢測(cè)體系見表2，擴(kuò)增程序優(yōu)化結(jié)果如下：95 ℃預(yù)變性15 s;95 ℃ 變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，變性延伸過程進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。退火結(jié)束時(shí)采集探針對(duì)應(yīng)的三重?zé)晒饧碏AM、HEX和CY5采集信號(hào)，每個(gè)基因擴(kuò)增設(shè)置陽性樣品、陰性樣品、空白對(duì)照，各設(shè)2個(gè)重復(fù)。陽性試驗(yàn)以轉(zhuǎn)基因大豆陽性質(zhì)控樣品DNA為模板，陰性試驗(yàn)以轉(zhuǎn)基因大豆陰性質(zhì)控樣品DNA為模板，空白對(duì)照以無菌水為擴(kuò)增模板。

1.3.5?三重?zé)晒釶CR檢測(cè)體系的靈敏度試驗(yàn)

將轉(zhuǎn)基因大豆陽性質(zhì)控樣品和轉(zhuǎn)基因陰性玉米樣品以質(zhì)量1 ∶9混合均勻，以“1.3.1”節(jié)的方法提取DNA， 再10倍逐級(jí)稀釋使陽性DNA占1%、0.1%。然后以大豆轉(zhuǎn)基因陽性質(zhì)控樣品DNA和陽性占比為10%、1%、0.1%的質(zhì)控樣品DNA為模板，按“13.5”節(jié)三重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系及程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)模板設(shè)置2個(gè)重復(fù)，觀察擴(kuò)增情況，記錄各DNA的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（CT）。

2?結(jié)果與分析

2.1?引物探針特異性檢測(cè)結(jié)果

2.1.1?CaMV 35S基因擴(kuò)增用引物和探針特異性檢測(cè)結(jié)果

如圖1所示，只有以轉(zhuǎn)基因大豆陽性質(zhì)控樣品DNA為模板時(shí)才有特異性擴(kuò)增，2個(gè)平行樣品的CT值為分別為23.61、24.55，而其他樣品DNA沒有擴(kuò)增。說明設(shè)計(jì)合成的大豆轉(zhuǎn)基因CaMV35S啟動(dòng)子檢測(cè)用引物和探針特異性良好，沒有交叉反應(yīng)。

2.1.2?大豆內(nèi)源Lectin基因擴(kuò)增用引物和探針特異性檢測(cè)結(jié)果

如圖2所示，當(dāng)以轉(zhuǎn)基因大豆陽性質(zhì)控樣品和陰性質(zhì)控樣DNA為模板時(shí)才有特異性擴(kuò)增，2個(gè)平行樣品的CT值分別為23.61、24.55和27.03、26.69。而非大豆樣品DNA和空白對(duì)照DNA均沒有擴(kuò)增。說明設(shè)計(jì)合成的大豆內(nèi)源基因Lectin檢測(cè)用引物和探針特異性良好，沒有交叉反應(yīng)。

2.1.3?NOS終止子基因擴(kuò)增用引物和探針特異性檢測(cè)結(jié)果

如圖3所示，只有以轉(zhuǎn)基因大豆陽性質(zhì)控樣品DNA為模板時(shí)才有特異性擴(kuò)增，CT值分別為28.14、28.02，而其他樣品DNA沒有擴(kuò)增。說明設(shè)計(jì)合成的大豆轉(zhuǎn)基因NOS終止子檢測(cè)用引物和探針特異性良好，沒有交叉反應(yīng)。

2.2?三重實(shí)時(shí)熒光PCR體系擴(kuò)增圖結(jié)果

如圖4、圖5、圖6所示，三重體系中陽性樣品各基因均有典型的“S”形擴(kuò)增，陰性樣品除Lectin基因外其余都沒有擴(kuò)增，試劑空白和提取過程空白均沒有擴(kuò)增。說明建立的三重PCR體系擴(kuò)增特異性良好，體系成立。

2.3?多重PCR體系的靈敏度測(cè)定

由圖7、圖8、圖9、表3可知，構(gòu)建的三重?cái)U(kuò)增體系中CaMV 35S基因、Lectin基因和NOS的檢測(cè)靈敏度均可以達(dá)到樣品質(zhì)量濃度的0.1%。

3?結(jié)論

本研究利用多重?zé)晒釶CR的優(yōu)勢(shì)，建立了可同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆啟動(dòng)子35S、終止子NOS和內(nèi)源基因Lectin的三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，可以通過1次PCR實(shí)現(xiàn)對(duì)大豆樣品的轉(zhuǎn)基因初級(jí)篩查。特異性和靈敏度檢測(cè)證明該方法可用于大豆樣品的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)效率，操作過程簡(jiǎn)單宜于推廣，對(duì)進(jìn)一步促進(jìn)分子生物學(xué)技術(shù)在檢驗(yàn)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用有一定的推動(dòng)作用。但該方法中NOS在三重體系中顯示檢測(cè)熒光值偏低，可能與CY5熒光值較弱有關(guān)，該體系也有待進(jìn)一步優(yōu)化，在不同品牌PCR儀間的適用性問題也有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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