高爽 王玉真 薄福民 張麗 孫越 楊山景 封安杰 李凌軍

摘 要 目的：提高女貞子總三萜中齊墩果酸和熊果酸的轉(zhuǎn)移率和純度，優(yōu)化該類成分的純化工藝。方法：以齊墩果酸和熊果酸作為女貞子藥材中總三萜類代表成分，采用高效液相色譜法測定兩者含量。色譜柱為Thermo BDS Hypersil C18，流動相為甲醇-0.02%乙酸銨溶液（80 ∶ 20，V/V），檢測波長為210 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。采用單因素試驗，以齊墩果酸、熊果酸的轉(zhuǎn)移率為指標，考察工藝中的水沉溫度、水沉時間和復溶乙醇用量對純化工藝的影響;以兩種成分的轉(zhuǎn)移率和純度為指標，考察活性炭用量、析晶乙醇體積分數(shù)對純化工藝的影響。在此基礎上，以復溶乙醇用量、活性炭用量、析晶乙醇體積分數(shù)為因素，采用Box-Behnken響應面法進一步優(yōu)化該純化工藝并驗證。結果：最佳純化工藝為女貞子藥材提取濃縮液加4倍量（mL/g，下同）水，在0 ℃靜置2 h（水沉）;然后加入藥材1倍量的乙醇溶解（復溶）;再加入4%的活性炭（除雜）;最后加水調(diào)整乙醇體積分數(shù)為80%，在4 ℃下靜置12 h（析晶），離心，干燥。3次驗證試驗結果顯示，采用該優(yōu)選純化工藝所制得的總三萜中齊墩果酸、熊果酸的轉(zhuǎn)移率分別為61.11%、65.78%，純度分別為53.44%、19.79%，RSD均小于3%。結論：優(yōu)化所得純化工藝提取效率高、操作簡便，可用于女貞子總三萜類成分純化的工業(yè)化生產(chǎn)以及相關制劑的開發(fā)。

關鍵詞 女貞子;總三萜;齊墩果酸;熊果酸;純化工藝

中圖分類號 R282;R284.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）18-2196-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.18.04

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To improve the transfer rate and purity of oleanolic acid and ursolic acid in total triterpenoids from Ligustrum lucidum， so as to optimize the purification technology. METHODS： Oleanolic acid and ursolic acid were used as representative components of total triterpenoids， and their contents were determined by HPLC. The determination was performed on Thermo BDS Hypersil C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.02% ammonium acetate solution （80 ∶ 20，V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 210 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 20 μL. In single factor tests， using transfer rate of oleanolic acid and ursolic acid as index， the effects of water precipitation temperature and time， the amount of redissolved ethanol on the purification technology was investigated; using transfer rate and purity of two components as indexes， the effects of the amount of activated carbon and volume fraction of crystallization ethanol were investigated. Based on it， using the amount of redissolved ethanol and activated carbon， volume fraction of crystallization ethanol as factors， Box-Behnken response surface methodology was used to optimize the purification technology， and validation tests were performed. RESULTS： The optimal purification technology was adding 4-fold （mL/g， the same below） water in L. lucidum concentrated solution， placing for 2 hours at 0 ℃ （water precipitation）; adding 1-fold ethanol to dissolve （redissolution）; adding 4% activated carbon （edulcoration）; finally adding water to adjust the volume fraction of ethanol to 80%， placing at 4 ℃ for 12 hours （crystallization）， centrifuging and drying. The results of 3 times of validation tests showed that the transfer rates of oleanolic acid and ursolic acid in total triterpenoids prepared by optimized technology were 61.11% and 65.78%， the purities of them were 53.44% and 19.79%， and RSDs were both lower than 3%. CONCLUSIONS： The optimized purification technology has high extraction efficiency and simple operation， which can be used for industrial production of purification of total triterpenoids from L. lucidum and the development of corresponding preparations.

KEYWORDS? ?Ligustrum lucidum; Total triterpenoids; Oleanolic acid; Ursolic acid; Purification technology

圍絕經(jīng)期是女性必經(jīng)的生理過程，在此階段出現(xiàn)的如月經(jīng)紊亂、心血管系統(tǒng)與代謝異常、泌尿生殖綜合征以及骨質(zhì)疏松等癥狀稱為圍絕經(jīng)綜合征（MPS）[1-2]。女貞子是木犀科植物女貞[Ligustrum lucidum Ait.]的干燥成熟果實，其藥用歷史悠久，具有補氣疏肝、滋補肝腎的功效，可解虛汗、煩熱骨蒸等癥，近年來在治療MPS及其并發(fā)癥等方面的作用受到了廣泛關注[3-5]。目前從女貞子中分離到的化合物主要有三萜類、環(huán)烯醚萜類、苯乙醇類以及黃酮類等成分[6]，其中女貞子總三萜的有效成分主要為齊墩果酸，而齊墩果酸和熊果酸互為異構體（化學結構式見圖1），通過溶劑法很難將兩者分離，故兩者常同時作為女貞子總三萜的代表成分[7];而且，兩種成分均具有廣泛的生物活性，如抗糖尿病[8]、抗腫瘤[9]、保肝[10]及抗骨質(zhì)疏松[11]等?；诖?，本研究在前期女貞子提取工藝研究的基礎上，以齊墩果酸和熊果酸作為女貞子總三萜的主要指標成分，以兩者的純度和轉(zhuǎn)移率為考察指標，通過單因素試驗和Box-Behnken響應面法，篩選女貞子總三萜的最佳純化工藝，為MPS治療新藥貞芍醇苷膠囊的研制和開發(fā)奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;KDM型電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）;DLSB-ZC型低溫循環(huán)真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;E-6000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）;TDL-5-A型離心機（上海安亭科學儀器廠）;DZF-6051型真空干燥箱（上海精宏試驗設備有限公司）;Free Zone型冷凍干燥機（美國Labconco公司）;BS110S型分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）;New Classic MC型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

齊墩果酸對照品（批號：110709-201607，純度：91.7%）、熊果酸對照品（批號：110742-201622，純度：94.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙酸銨、異丙醇為色譜純，乙醇、活性炭等其余試劑均為分析純，水為超純水（山東中醫(yī)藥大學自制）。

女貞子藥材（批號：20170601）購自安徽九合堂國藥有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學藥學院李峰教授鑒定為木犀科植物女貞[L. lucidum Ait.]的干燥成熟果實，按照2015年版《中國藥典》（一部）“女貞子”項下要求檢查，結果均符合規(guī)定[12]。

2 樣品溶液的制備

2.1 對照品貯備液

精密稱取齊墩果酸對照品11.26 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.413 0 mg/mL的齊墩果酸對照品貯備液;精密稱取熊果酸對照品11.40 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.215 9 mg/mL的熊果酸對照品貯備液。

2.2 女貞子藥材提取濃縮液

根據(jù)本課題組前期研究的提取工藝[13]，稱取女貞子藥材適量，分別加入8、6、4倍量（按mL/g計，下同）的60%乙醇，加熱回流提取3次，每次提取3 h;合并提取液，減壓濃縮至1 g/mL（以原藥材量計），即得。

2.3 總三萜純化工藝供試品溶液

精密稱取純化工藝相應步驟所得干燥沉淀物10.00 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3 齊墩果酸和熊果酸含量測定方法的建立

3.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性考察

色譜柱：Thermo BDS Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇-0.02%乙酸銨溶液（80 ∶ 20，V/V）;檢測波長：210 nm;柱溫：30 ℃;流速：1.0 mL/min;進樣量：20 μL。取齊墩果酸、熊果酸對照品溶液（“2.1”項下對照品貯備液以甲醇適度稀釋）和供試品溶液，以甲醇為空白溶劑，進樣分析，記錄色譜圖。結果，齊墩果酸、熊果酸理論板數(shù)均大于10 000，分離度均大于1.5，空白溶劑不干擾測定。色譜圖見圖2（空白溶劑圖略）。

3.2 方法學考察

3.2.1 線性關系考察 精密吸取“2.1”項下齊墩果酸、熊果酸對照品貯備液適量，分別加甲醇稀釋，制備齊墩果酸質(zhì)量濃度分別為0.413 0、0.330 4、0.247 8、0.165 2、0.082 60、0.020 65 mg/mL，熊果酸質(zhì)量濃度分別為0.215 9、0.172 7、0.129 5、0.086 36、0.043 18、0.010 80 mg/mL的系列對照品溶液。取上述對照品溶液，按“3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。分別以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X，mg/mL）、峰面積為縱坐標（Y）進行回歸分析，結果得齊墩果酸回歸方程為Y=9 456.7X+28.773（R 2=0.999 0）、熊果酸回歸方程為Y=9 744.9X+41.257（R 2=0.999 3），表明齊墩果酸、熊果酸分別在0.020 65～0.413 0、0.010 80～0.215 9 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

3.2.2 精密度試驗 精密量取“2.1”項下齊墩果酸、熊果酸對照品貯備液，分別加甲醇稀釋至0.247 8、0.129 5 mg/mL，再分別按“3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD分別為0.26%、0.77%（n=6），表明儀器精密度良好。

3.2.3 穩(wěn)定性試驗 取“2.3”項下供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h后，分別按“3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD分別為1.35%、2.20%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.4 重復性試驗 精密移取“2.3”項下供試品溶液6份，按“3.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，并按標準曲線法計算齊墩果酸、熊果酸含量。結果，兩者含量的RSD分別為1.17%、0.63%（n=6），表明該方法重復性良好。

3.2.5 加樣回收試驗 精密量取齊墩果酸、熊果酸質(zhì)量濃度分別為3.102、1.623 mg/mL的供試品溶液適量，共12份，每6份為一組，各組溶液中分別精密加入質(zhì)量濃度分別為3.100 mg/mL、1.621 mg/mL的齊墩果酸或熊果酸對照品溶液適量，按照“3.1”項下色譜條件進樣測定并計算加樣回收率。結果，齊墩果酸、熊果酸的平均回收率分別為100.24%、101.51%，RSD均為0.06%（n=6），表明該方法準確度良好。

4 單因素試驗考察女貞子中三萜類成分純化工藝的影響因素

本課題組通過前期工藝探索后發(fā)現(xiàn)，水沉可除去環(huán)烯醚萜苷等極性較大的成分，將沉淀用乙醇復溶后再加活性炭可除去色素等雜質(zhì)，最后通過調(diào)整乙醇體積分數(shù)，可使齊墩果酸、熊果酸等三萜類成分析出?；诖?，本研究以齊墩果酸和熊果酸轉(zhuǎn)移率為指標，對工藝中的水沉溫度、水沉時間及復溶乙醇用量進行單因素考察;以上述2種成分的轉(zhuǎn)移率和純度為指標，對工藝中的活性炭用量、析晶乙醇體積分數(shù)進行單因素考察。

4.1 水沉溫度

精密量取“2.2”項下女貞子藥材提取濃縮液5份，每份50 mL，加4倍量水，加熱至沸騰后，分別在80、60、40、20、0 ℃條件下靜置2 h，以4 500 r/min離心5 min（以下同），取下層沉淀，冷凍干燥。精密稱取所得干燥沉淀物10.00 mg，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“3”項下方法測定齊墩果酸和熊果酸的含量，并計算其轉(zhuǎn)移率（轉(zhuǎn)移率=待測成分測得量/待測成分加入量×100%），結果見表1。由表1可知，水沉溫度越低，所得干燥沉淀物中齊墩果酸、熊果酸的轉(zhuǎn)移率越高。水沉的目的是除去環(huán)烯醚萜苷等極性大的成分，需盡可能保證有效成分的轉(zhuǎn)移率，故選擇水沉溫度0 ℃進行后續(xù)工藝優(yōu)化。

4.2 水沉時間

精密量取“2.2”項下女貞子藥材提取濃縮液6份，每份50 mL，加4倍量水，加熱至沸騰后，分別在0 ℃條件下靜置0、1、2、4、8、12 h，離心，取下層沉淀，冷凍干燥。精密稱取所得干燥沉淀物10.00 mg，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“3”項下方法測定齊墩果酸和熊果酸的含量，并計算其轉(zhuǎn)移率，結果見表2。由表2可知，當水沉時間超過2 h后，隨著水沉時間的延長，所得干燥沉淀物中齊墩果酸、熊果酸的轉(zhuǎn)移率未見明顯增加，甚至有所降低，故考慮到時間成本和轉(zhuǎn)移效率，選擇水沉時間2 h進行后續(xù)工藝優(yōu)化。

4.3 復溶乙醇用量

精密量取“2.2”項下女貞子藥材提取濃縮液6份，每份50 mL，加4倍量水，加熱至沸騰后，分別在0 ℃條件下靜置2 h，離心，取下層沉淀，冷凍干燥。取干燥沉淀物，分別加入0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5倍量乙醇復溶（沉淀物均折算為原藥材量后再計算相應復溶乙醇倍量，下同），加熱回流0.5 h后，離心，取上清液，用乙醇定容至50 mL。精密量取該乙醇稀釋溶液1.0 mL，加甲醇稀釋至10 mL，再按“3”項下方法測定齊墩果酸和熊果酸的含量，并計算其轉(zhuǎn)移率，結果見表3。由表3可知，當復溶乙醇用量為0.5倍量時，齊墩果酸和熊果酸的轉(zhuǎn)移率明顯高于乙醇用量為0.25倍量時的轉(zhuǎn)移率;當以1.0倍量乙醇復溶后，齊墩果酸、熊果酸的轉(zhuǎn)移率已達到較高水平，再繼續(xù)增加乙醇用量，兩種成分轉(zhuǎn)移率未見明顯提高，反而造成溶劑浪費，故選擇復溶乙醇用量1.0倍量進行后續(xù)工藝優(yōu)化。

4.4 活性炭用量

精密量取“2.2”項下女貞子藥材提取濃縮液5份，每份50 mL，加4倍量水，加熱至沸騰后，在0 ℃條件下靜置2 h，離心，取下層沉淀，冷凍干燥。取干燥沉淀物，加1.0倍量乙醇復溶，加熱回流0.5 h后，離心，取上清液，用乙醇定容至50 mL。在上述乙醇稀釋溶液中分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g活性炭（相當于含活性炭1%、2%、3%、4%、5%），振搖10 min，抽濾，取濾液，用乙醇定容至50 mL。將該溶液蒸干，取干燥沉淀物，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“3”項下方法測定齊墩果酸和熊果酸的含量，并計算其轉(zhuǎn)移率和純度（純度=待測成分質(zhì)量/沉淀質(zhì)量×100%），結果見表4。由表4可知，所得干燥沉淀物中齊墩果酸、熊果酸的轉(zhuǎn)移率隨活性炭用量增加而降低，但純度隨活性炭用量增加而升高。結合轉(zhuǎn)移率和純度計算綜合評分（綜合評分=x轉(zhuǎn)移率/∑x轉(zhuǎn)移率+? ?y純度/∑y純度），結果見表4。根據(jù)綜合評分，選擇活性炭用量4%進行后續(xù)工藝優(yōu)化。

4.5 析晶乙醇體積分數(shù)

精密量取“2.2”項下女貞子藥材提取濃縮液4份，每份50 mL，加4倍量水，加熱至沸騰后，在0 ℃條件下靜置2 h，離心，取下層沉淀，冷凍干燥。取干燥沉淀物，加入1.0倍量乙醇，加熱回流0.5 h后，離心，取上清液，用乙醇定容至50 mL。在上述乙醇稀釋溶液中加入4%的活性炭，振搖10 min，抽濾，取濾液，加乙醇定容至50 mL。在上述乙醇稀釋溶液中分別加水調(diào)整乙醇體積分數(shù)至80%、60%、40%、20%，然后于4 ℃冷藏靜置12 h析晶。取析晶后溶液，離心，取下層沉淀，冷凍干燥。精密稱取該干燥沉淀物10.00 mg，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“3”項下方法測定齊墩果酸和熊果酸含量，并計算其轉(zhuǎn)移率和純度，結果見表5。在實際操作過程中筆者發(fā)現(xiàn)，以20%乙醇進行析晶，離心后沉淀與上清液未能較好分離，且提高離心轉(zhuǎn)速或延長離心時間均無改善;以40%乙醇進行析晶效果略好，但離心后分離效果仍然較差，故乙醇體積分數(shù)過低不利于女貞子總三萜類成分的析出。由表5可知，以60%乙醇進行析晶時，雖然齊墩果酸和熊果酸的轉(zhuǎn)移率稍高，但兩者純度均未達到50%;而以80%乙醇進行析晶時，雖齊墩果酸純度達到50%，但兩者轉(zhuǎn)移率又過低?？紤]到上述試驗樣本量小，操作過程中的損失比較大，后續(xù)可進行大樣本試驗來驗證工藝是否合理，故選擇乙醇體積分數(shù)80%進行后續(xù)工藝優(yōu)化。

5 Box-Behnken響應面法優(yōu)化女貞子總三萜類的純化工藝

根據(jù)單因素考察結果可知，水沉溫度0 ℃和水沉時間2 h在提高目標分轉(zhuǎn)移率方面優(yōu)勢明顯，故設為固定值，以齊墩果酸、熊果酸的純度和轉(zhuǎn)移率為考察指標，進一步對復溶乙醇用量（A，倍）、活性炭用量（B，%）、析晶乙醇體積分數(shù)（C，%）這3個因素進行優(yōu)化。取“2.2”項下女貞子藥材提取濃縮液17份，每份50 mL，按Box-Behnken響應面法設計試驗。試驗因素和水平見表6，試驗設計和結果見表7，方差分析見表8。

根據(jù)上述擬合的二項式方程，采用Design-Expert 8.0.6軟件分別繪制三維效應圖，考察各自變量對女貞子總三萜純化工藝的影響，結果見圖3。由圖3可知，因素A、C的交互作用對女貞子總三萜純化工藝的影響較大，其次是因素B、C的交互作用，而因素A、B的交互作用影響最不顯著。

運用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化所得女貞子總三萜純化的最佳工藝參數(shù)為：1.22倍的乙醇用量、3.98%的活性炭、78.53%的乙醇體積分數(shù);按此最佳純化工藝制得的女貞子總三萜產(chǎn)物的綜合評分為55.18。為后續(xù)方便工業(yè)大生產(chǎn)操作，將各參數(shù)分別取整，以乙醇用量1.0倍、活性炭4%、乙醇體積分數(shù)80%進行工藝驗證。

6 女貞子總三萜最佳純化工藝驗證

根據(jù)上述優(yōu)化工藝參數(shù)，精密量取“2.2”項下女貞子藥材提取濃縮液3份，每份500 mL，加4倍量水，加熱至沸騰后，在0 ℃下靜置2 h，離心，取下層沉淀，冷凍干燥;干燥沉淀物中加入1.0倍量乙醇復溶，加熱回流0.5 h后，離心，取上清液，以乙醇定容至500 mL;加入4%的活性炭除雜，振搖10 min，抽濾，濾液加乙醇定容至500 mL;加水調(diào)節(jié)乙醇體積分數(shù)為80%，4 ℃下冷藏靜置12 h析晶;離心，取沉淀，冷凍干燥。取干燥產(chǎn)物，分別按“2.3”“3”項下方法制備供試品溶液、測定齊墩果酸和熊果酸含量并計算其轉(zhuǎn)移率和純度，結果見表9。結果顯示，齊墩果酸的平均轉(zhuǎn)移率和純度分別為61.11%、53.44%，RSD分別為1.33%、1.34%（n=3）;熊果酸的平均轉(zhuǎn)移率和純度分別為65.78%、19.79%，RSD分別為2.44%、2.43%（n=3）;綜合評分均大于66，RSD為0.73%（n=3）。

7 討論

女貞子具有一定的抗氧化、延緩衰老的作用，研究證明其三萜類成分能夠增強人體對氧自由基的抵抗力，具有清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的能力[14]。女性在絕經(jīng)后易患骨質(zhì)疏松，而現(xiàn)有研究已明確了女貞子治療骨質(zhì)疏松的藥理作用，目前學界普遍認為，女貞子中的齊墩果酸、熊果酸、特女貞苷等均可通過促進骨細胞分化、阻滯破骨細胞激活或者增殖等途徑發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用[15-18]。

本課題組前期對女貞子的提取工藝進行研究，優(yōu)化了女貞子藥材的提取工藝[13]，并通過大孔吸附樹脂優(yōu)化特女貞苷的純化工藝。在此基礎上，本研究對齊墩果酸、熊果酸進行純化工藝研究：首先對水沉溫度、水沉時間、復溶乙醇用量、活性炭用量、析晶乙醇體積分數(shù)等進行單因素試驗，再以此為基礎進行響應面試驗設計。通過分析得到最佳純化工藝為：水沉——藥材提取濃縮液中加4倍量水，0 ℃下靜置2 h;復溶——加入藥材1.0倍量的乙醇溶解;除雜——加入4%的活性炭;析晶——加水調(diào)整乙醇體積分數(shù)至80%，4 ℃下靜置12 h，離心，干燥。結果顯示，通過優(yōu)選純化工藝所制得的女貞子總三萜中齊墩果酸、熊果酸的轉(zhuǎn)移率分別為61.11%、65.78%，純度分別為53.44%、19.79%， 綜合評分大于66，RSD均小于3%，表明優(yōu)選工藝穩(wěn)定、可行。

綜上，本研究優(yōu)化所得純化工藝提取效率高、操作簡便，可用于女貞子總三萜類成分純化的工業(yè)化生產(chǎn)以及后續(xù)貞芍醇苷膠囊等相關制劑的開發(fā)?？紤]到齊墩果酸幾乎不溶于水、在水中的溶出度極低、細胞滲透性差[19-20]，且肝腸首關效應強[21-22]、口服生物利用度極差，后續(xù)擬采用固體分散體制劑技術有效提高其溶出度和生物利用度[23-24]，以提高貞芍醇苷膠囊的藥效作用。

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（收稿日期：2020-02-19 修回日期：2020-08-09）

（編輯：段思怡）