袁小波 唐靜

卵巢癌是婦科腫瘤中危害最為嚴(yán)重的惡性腫瘤,嚴(yán)重危害女性的身體健康,該疾病早期難于診斷,病發(fā)后難于防治[1]。 目前主要通過手術(shù)治療切除病灶,緩解腫瘤增生,但術(shù)后復(fù)發(fā)概率高[2]。因此,急需開發(fā)具有針對性的治療藥物,提高治療效果,減少疾病復(fù)發(fā)。 女貞子多糖是木樨科植物女貞子的主要有效成分,其具有抗腫瘤作用[3]。據(jù)報道,女貞子多糖可抑制黑色素瘤細胞的粘附能力[4]。 但女貞子多糖對卵巢癌細胞惡性生物學(xué)行為的影響鮮有報道。 此外,表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)/有絲分裂原活性蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路是控制細胞生長過程中最重要的通路之一,可介導(dǎo)細胞的生長與分化,最終加速細胞增殖[5-6]。 相關(guān)研究表明,抑制EGFR/MAPK 信號通路可抑制卵巢癌細胞增殖、侵襲[7]。 而女貞子多糖能否通過調(diào)控EGFR/MAPK 信號通路影響卵巢癌細胞惡性生物學(xué)行為尚不明確。 因此,本研究主要探究女貞子多糖對卵巢癌細胞增殖、凋亡的影響以及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

女貞子多糖(批號:20180526)購于陜西鴻澤生物工程有限公司,胎牛血清(批號:20150410)購于普利萊(北京)基因技術(shù)有限公司,pcDNA3.1-EGFR及其對照品由吉瑪生物科技有限公司合成,甲基噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒(批號:20171107)購于上海紀(jì)寧生物科技有限公司,凋亡檢測試劑(批號:20180923)購于翌圣生物科技有限公司,三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 抗 體 ( 批 號:20171011)、 EGFR 抗 體 (批 號:20161203)、 p-EGFR 抗體(批號:20170621)、p-P38 MAPK 抗體(批 號: 20190517)、 P38 MAPK 抗 體 ( 批 號:20180620)、B 細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體(批號:20190527)、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax) 抗 體 (批 號:20171024)及免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗(批號:20180925)購于abcam 公司。

1.2 主要儀器

熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司,型號:7500);蛋白凝膠成像系統(tǒng)(上海生工生物公司,型號:HE-120)。

1.3 細胞來源

人上皮性卵巢癌HO8910 細胞購于中科院上海細胞研究所。

1.4 細胞培養(yǎng)與分組

將HO8910 細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中,進行常規(guī)細胞傳代培養(yǎng),取對數(shù)生長期的HO8910 細胞用于后續(xù)實驗。

將對數(shù)生長期的HO8910 細胞(濃度1×108/L)分別用終濃度為 0 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 女貞子多糖處理48 小時,并命名為對照組、女貞子多糖低劑量組、女貞子多糖中劑量組、女貞子多糖高劑量組。 此外, 另將對數(shù)生長期的HO8910 細胞設(shè)置為pcDNA-EGFR 組(轉(zhuǎn)染pcDNAEGFR)、 女 貞 子 多 糖 + pcDNA-EGFR 組 ( 轉(zhuǎn) 染pcDNA-EGFR 和10 μg/mL 女貞子多糖共同處理)、女貞子多糖+pcDNA 組(轉(zhuǎn)染 pcDNA 和10 μg/mL女貞子多糖共同處理),各組細胞持續(xù)培養(yǎng)48 小時,每組設(shè)置6 個復(fù)孔。

1.5 MTT 法檢測HO8910 細胞增殖

將各組細胞懸液(1×105)在96 孔板中經(jīng)相應(yīng)處理干預(yù)48 小時后,向每孔加入20 μL MTT,37℃培養(yǎng)4 小時后將培養(yǎng)液倒出,加入150 μL DMSO,混勻后置于搖床持續(xù)振蕩10 分鐘,酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處的光吸收值,每組設(shè)置6 個復(fù)孔,實驗重復(fù)3 次。

1.6 流式細胞術(shù)檢測HO8910 細胞凋亡

將各組細胞懸液(1×105)在96 孔板中經(jīng)相應(yīng)處理干預(yù)48 小時后,離心收集細胞懸液,用5 μL Annexin V-FITC 和 10 μL PI 避光孵育 15 分鐘后,再加入500 μL PBS 重懸細胞,使用流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。 細胞凋亡率(%)= (凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)) ×100%,每組設(shè)置 6 個復(fù)孔,實驗重復(fù)3 次。

1.7 Western blot 檢測 HO8910 細胞中 EGFR、p-EGFR、p-P38 MAPK、P38 MAPK、Bcl-2、Bax 蛋白表達

收集經(jīng)相應(yīng)處理干預(yù)48 小時后的各組細胞,用放射免疫沉淀分析法(radio immuno precipit ationassay,RIPA)裂解液提取總蛋白,將蛋白質(zhì)進行定量、電泳、轉(zhuǎn)膜,封閉后,加入一抗 GAPDH、EGFR、p-EGFR、p-P38 MAPK、P38 MAPK、Bcl-2、Bax,均按1 ∶1500 比例稀釋,4℃孵育過夜。 清洗三次,加入二抗(1 ∶2000),常溫孵育1 小時,清洗3 次,加入增強化學(xué)發(fā)光劑(enhanced chemilum inescence,ECL)觀察蛋白顯色情況,Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值,每組設(shè)置6 個復(fù)孔,實驗重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用軟件SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料均符合正態(tài)分布,方差齊,所有數(shù)據(jù)通過均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()體現(xiàn),多組間差異用單因素方差分析進行比較,兩兩比較采用SNK-q檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量女貞子多糖對HO8910 細胞增殖、凋亡的影響

與對照組相比,女貞子多糖低劑量組、女貞子多糖中劑量組、女貞子多糖高劑量組OD 值、Bcl-2蛋白表達量顯著降低,細胞凋亡率、Bax 蛋白表達量顯著升高,且呈劑量依賴性(P<0.05)。 見表1、圖1 ~2。

圖1 流式細胞術(shù)檢測不同劑量女貞子多糖對HO8910 細胞凋亡的影響

表1 不同劑量女貞子多糖對HO8910 細胞增殖、凋亡的影響(,n=6)

表1 不同劑量女貞子多糖對HO8910 細胞增殖、凋亡的影響(,n=6)

注: 與對照組相比,aP<0.05;與女貞子多糖低劑量組相比,bP<0.05;與女貞子多糖中劑量組相比,cP<0.05。

0.000 0.000 0.000 0.000組別 OD 值(490 nm) 細胞凋亡率(%)0.629±0.041 1.28±0.17 1.64±0.18 0.40±0.11女貞子多糖低劑量組 0.478±0.038a 4.84±0.63a 1.29±0.14a 0.78±0.18a女貞子多糖中劑量組 0.384±0.043ab 16.13±1.48ab 0.93±0.21ab 1.26±0.21ab女貞子多糖高劑量組 0.272±0.036abc 24.47±3.73abc 0.55±0.13abc 1.87±0.14abc F 值 87.430 163.751 46.660 89.381 P 值Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH對照組

2.2 不同劑量女貞子多糖對 HO8910 細胞中EGFR/MAPK 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與對照組相比,女貞子多糖低劑量組、女貞子多糖中劑量組、女貞子多糖高劑量組 p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 顯著降低,且呈劑量依賴性(P<0.05)。 見表2、圖3。

圖3 Western blot 檢測不同劑量女貞子多糖對HO8910細胞中p-EGFR、EGFR、p-MAPK、MAPK 蛋白表達量的影響

表2 不同劑量女貞子多糖對HO8910 細胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影響(,n=6)

表2 不同劑量女貞子多糖對HO8910 細胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影響(,n=6)

注: 與對照組相比,aP<0.05;與女貞子多糖低劑量組相比,b P<0.05;與女貞子多糖高劑量組相比,cP<0.05。

0.000 0.000組別0.83±0.04 0.80±0.05女貞子多糖低劑量組 0.74±0.05a 0.69±0.04a女貞子多糖中劑量組 0.61±0.07ab 0.53±0.06ab女貞子多糖高劑量組 0.21±0.03abc 0.17±0.04abc F 值 181.556 195.161 P 值p-EGFR/EGFR p-MAPK/MAPK對照組

圖2 Western blot 檢測不同劑量女貞子多糖對HO8910 細胞中Bcl-2、Bax 蛋白表達量的影響

2.3 過表達 EGFR 逆轉(zhuǎn)高劑量女貞子多糖對HO8910 細胞中EGFR/MAPK 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與對照組相比,pcDNA-EGFR 組p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 顯著升高(P<0.05);與女貞子多糖+pcDNA 組相比,女貞子多糖+pcDNA-EGFR 組 p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見表3 ~4、圖4。

表3 過表達EGFR 對HO8910 細胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影響()

表3 過表達EGFR 對HO8910 細胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影響()

6 0.83±0.04 0.80±0.05 pcDNA-EGFR 組 6 0.94±0.06 0.92±0.06 t 值 -3.734 -3.764 P 值對照組0.004 0.004 p-EGFR/EGFR p-MAPK/MAPK組別 n

表4 過表達EGFR 逆轉(zhuǎn)女貞子多糖對HO8910 細胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影響(,n=6)

表4 過表達EGFR 逆轉(zhuǎn)女貞子多糖對HO8910 細胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影響(,n=6)

0.24±0.05 0.19±0.03女貞子多糖+pcDNA-EGFR 組 0.73±0.04 0.56±0.05 t 值 -18.745 -15.543 P 值p-EGFR/EGFR p-MAPK/MAPK女貞子多糖+pcDNA 組組別0.000 0.000

圖4 Western blot 檢測各組HO8910 細胞中p-EGFR、EGFR、p-MAPK、MAPK 蛋白表達量

2.4 過表達EGFR 逆轉(zhuǎn)高劑量女貞子多糖對HO8910 細胞增殖、凋亡的影響

與對照組相比,pcDNA-EGFR 組 OD 值、Bcl-2蛋白表達量顯著升高,細胞凋亡率、Bax 蛋白表達量顯著降低(P<0.05);與女貞子多糖+pcDNA 組相比,女貞子多糖+pcDNA-EGFR 組 OD 值、Bcl-2 蛋白表達量顯著升高,細胞凋亡率、Bax 蛋白表達量顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見表5 ~6、圖5 ~6。

圖5 流式細胞術(shù)檢測過表達EGFR 逆轉(zhuǎn)高劑量女貞子多糖對HO8910 細胞凋亡的影響

表5 過表達EGFR 對HO8910 細胞增殖、凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響(,n=6)

表5 過表達EGFR 對HO8910 細胞增殖、凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響(,n=6)

0.629±0.041 1.28±0.17 2.14±0.18 0.47±0.11 pcDNA-EGFR 組 0.741±0.068 0.87±0.19 2.49±0.16 0.25±0.07 t 值 -3.455 3.939 -3.560 4.133 P 值Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH對照組組別 OD 值(490 nm) 細胞凋亡率(%)0.006 0.003 0.005 0.002

表6 過表達EGFR 逆轉(zhuǎn)女貞子多糖對HO8910 細胞增殖、凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響(,n=6)

表6 過表達EGFR 逆轉(zhuǎn)女貞子多糖對HO8910 細胞增殖、凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響(,n=6)

0.265±0.042 23.88±3.83 0.62±0.11 1.82±0.13女貞子多糖+pcDNA-EGFR 組 0.452±0.048 3.73±0.39 1.67±0.17 0.72±0.14 t 值 -7.182 12.821 -12.702 14.103 P 值Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH女貞子多糖+pcDNA 組組別 OD 值(490 nm) 細胞凋亡率(%)0.000 0.000 0.000 0.000

圖6 Western blot 檢測過表達EGFR 逆轉(zhuǎn)高劑量女貞子多糖對HO8910 細胞中Bcl-2、Bax 蛋白表達量的影響

3 討論

卵巢癌是一種發(fā)生在卵巢的惡性腫瘤,近年來在我國發(fā)病率仍較高[8]。 該病可使患者產(chǎn)生強烈的腹部疼痛,引發(fā)多種消化道癥狀,嚴(yán)重時甚至危害女性生命[9]。 目前僅能通過手術(shù)加以治療,并通過藥物進行緩解,但能有極高的復(fù)發(fā)率[10]。 開發(fā)具有針對性的治療藥物,抑制卵巢癌組織的生長和擴散,成為當(dāng)前的重中之重[11]。 近年來隨著中醫(yī)藥領(lǐng)域進一步發(fā)展,通過中藥提取物治療相關(guān)疾病的研究逐漸增多,越來越多的證據(jù)表明,中藥提取物對于癌癥細胞的生長具有抑制作用,推測部分中藥提取物可用于治療緩解癌癥細胞的增殖[12-13]。 女貞子屬木樨科,是植物女貞的果實,被證實具有抗癌效果,目前已被應(yīng)用于開發(fā)抗癌藥物,是多種抗癌保健品的成分之一[14]。 相關(guān)研究顯示,女貞子多糖可通過降低淋巴瘤細胞表面唾液酸含量來抑制淋巴瘤進展[15],表明女貞子多糖具有抗腫瘤作用。 而女貞子多糖能否抑制卵巢癌進展尚不可知。 本研究通過不同劑量的女貞子多糖處理卵巢癌HO8910細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量女貞子多糖處理后,HO8910 細胞OD 值顯著降低,細胞凋亡率顯著升高,且呈劑量依賴性,表明女貞子多糖可加速細胞凋亡,抑制細胞增殖,進而抑制卵巢癌進展。

有文獻指出,Bax 作為線粒體蛋白,可與線粒體膜結(jié)合,促進凋亡因子表達[16]。 Bcl-2 作為抗凋亡蛋白,可減少凋亡因子的產(chǎn)生,抑制細胞凋亡。Bax、Bcl-2 蛋白表達量是評估細胞凋亡水平的重要依據(jù)[17]。 本研究發(fā)現(xiàn),不同劑量的女貞子多糖處理卵巢癌細胞后,Bcl-2 蛋白表達量顯著降低,Bax 蛋白表達量顯著升高,表明女貞子多糖通過調(diào)控Bax、Bcl-2 蛋白表達,促進細胞凋亡,但具體的作用機理仍有待進一步探索。

EGFR 作為常見的細胞膜受體,廣泛存在于人體多種類型的細胞中,在細胞生長過程中發(fā)揮重要作用,可參與啟動細胞周期,加速細胞繁殖[18]。EGFR 同樣參與癌細胞的增生,促進腫瘤產(chǎn)生,例如其在卵巢癌組織中高水平表達,被認為是評估卵巢癌惡化程度的重要標(biāo)志[19]。 EGFR 的磷酸化可進一步激活MAPK 信號通路,促進腫瘤細胞的快速生長[20]。 據(jù)報道,抑制EGFR/MAPK 通路可抑制乳腺癌進展[21]。 本實驗發(fā)現(xiàn),與對照組相比,過表達EGFR 后,EGFR、MAPK 磷酸化程度顯著升高,OD值、Bcl-2 蛋白表達量顯著升高,細胞凋亡率、Bax 蛋白表達量顯著降低,表明EGFR/MAPK 信號通路可促進卵巢癌細胞增殖,抑制細胞凋亡。 此外,有研究表明,以女貞子作為主要成分的中藥可參與調(diào)控EGFR,緩解非小細胞肺癌進展[22],推測女貞子多糖可能通過調(diào)控EGFR/MAPK 信號通路,抑制卵巢癌細胞增殖,促進細胞凋亡。 本研究顯示,與對照組相比,不同劑量的女貞子多糖處理卵巢癌細胞后,EGFR、MAPK 磷酸化程度顯著降低,表明女貞子多糖很可能通過調(diào)控EGFR/MAPK 信號通路發(fā)揮作用,為進一步驗證女貞子多糖在通路中是否發(fā)揮作用,本實驗在高劑量女貞子多糖處理的同時再轉(zhuǎn)染pcDNA-EGFR 來干預(yù)HO8910 細胞,結(jié)果顯示,過表達EGFR 減弱了高劑量女貞子多糖對HO8910 細胞增殖的抑制,以及細胞凋亡的促進作用,進一步驗證相關(guān)推論。

綜上所述,女貞子多糖可能通過抑制EGFR/MAPK 信號通路,進而抑制HO8910 細胞增殖,促進細胞凋亡。 然而,本研究尚存在不足之處,女貞子多糖是否還通過其他作用通路間接參與調(diào)控卵巢癌細胞增殖和凋亡,還有待進一步實驗加以說明。