錢峻 嚴富國 陳文山 陳允 黃海平 葉明燕

近年來研究表明，含有Ly6/Plaur結(jié)構(gòu)域的高度糖基化的磷脂酰肌醇錨定蛋白8（Ly6/Plaur domain-containing protein 8，LYPD8）有助于大腸細菌與腸上皮細胞的分離[1]。此外，LYPD8在結(jié)腸上皮細胞中表達，而在一些潰瘍性結(jié)腸炎患者的結(jié)腸組織中LYPD8表達有所降低[2]。目前關(guān)于LYPD8在結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）中的生物學(xué)功能有待進一步闡明。筆者將CRC組織與相應(yīng)的癌旁組織及正常組織進行了比較，檢測了不同CRC組織中LYPD8的表達、信號傳導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子3（signal transducer and activator of transcrip－tion 3，STAT3）/NF-κB p65 的磷酸化作用以及 IL-6/TNF-α的分泌水平；并將LYPD8在CRC細胞中過表達，研究其對CRC細胞增殖和遷移的影響，以探討LYPD8在CRC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本 組織標(biāo)本來自于2015年3月至2016年9月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬新昌醫(yī)院接受CRC根治術(shù)的40例患者，其中男26例，女14例；年齡45～70（56.3±3.4）歲；臨床TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期14例，Ⅲ期13例，Ⅳ期6例；所有患者術(shù)前未接受放療、化療和免疫治療。取其手術(shù)切除的CRC組織、正常結(jié)直腸組織（距離癌組織邊緣＞3 cm）和癌旁結(jié)直腸組織（距離癌組織邊緣≤3 cm）進行檢測。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.3 組織標(biāo)本病理學(xué)觀察 采用免疫熒光染色法。將組織在4%多聚甲醛溶液中固定過夜、脫水、石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟，在梯度乙醇中水化，抗原修復(fù)。3% H2O2處理切片后用10%山羊血清封閉切片，4℃下用STAT3抗體（ab68153，英國Abcam公司）和p65抗體（ab32536，英國Abcam公司）孵育過夜，然后二抗溫育 1 h。使用 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（C1002，中國碧云天生物技術(shù)公司）對細胞核染色5 min，在共聚焦激光顯微鏡（LSM780，德國ZEISS公司）下觀察染色結(jié)果。

1.4 蛋白表達檢測 采用Western blot法。按相關(guān)文獻報道的方法進行組織或細胞的蛋白質(zhì)提取和電泳分離[3]。電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（IPVH00010，德國Millipore公司）上，再在5%脫脂牛奶中封閉 1 h，與 STAT3抗體、p-STAT3抗體（AF3294，美國 Affnity Biosciences公司）、p65抗體、p-p65抗體（AF2006，美國Affnity Biosciences公司）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體（AP0063，美國Bioworld Technology公司）4℃孵育過夜。然后與堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（A0239，中國碧云天生物技術(shù)公司）室溫下孵育2 h。洗滌后，將膜與顯色底物在室溫下孵育5 min，使用蛋白凝膠成像系統(tǒng)（VersaDoc 3000，美國 Bio-Rad Laboratories公司）進行檢測和拍照；使用Image J軟件分析條帶強度，計算蛋白相對表達量[首先將圖片轉(zhuǎn)化為8位灰度圖（去除背景），然后選擇條帶進行編號，通過軟件分析繪制出選擇條帶的峰圖，對每個峰的中間區(qū)域?qū)?yīng)峰面積進行計算，用目標(biāo)蛋白的面積值除以內(nèi)參蛋白的面積值得到相對表達量]。

1.5 細胞因子檢測 采用ELISA法。使用IL-6試劑盒（HM10205，中國貝茵萊生物科技公司）、TNF-α試劑盒（HM10001，中國貝茵萊生物科技公司）進行IL-6、TNF-α定量分析，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.6 基因表達檢測 采用RT-PCR法。使用Mini BEST Universal RNA Extraction試劑盒（9767，日本 Takara公司）提取總 RNA，NanoDrop One（ND-ONE-W，美國Thermo Scientific公司）進行定量分析。使用PCR基因擴增儀（KB0365006，美國 Bio-Rad Laboratories公司）、PrimeScriptRT試劑盒（6210A，日本Takara公司）獲得反轉(zhuǎn)錄cDNA。使用RT-PCR系統(tǒng)（CFX96，美國Bio-Rad Laboratories公司）、SYBR Premix Ex Taq試劑盒（RR820A，日本Takara公司）進行RT-PCR。引物序列如下：LYPD8 為 5′-CGAAAGTTTGAGTGTGCAAATGT-3′和5′-CAGAGCAGGGAAAGAGGGTGT-3′，β-actin 為 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′和 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。以β-actin為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法計算 mRNA 相對表達量。

1.7 細胞增殖實驗 采用CCK-8法。將上述不同處理組SW480細胞接種在96孔板中，按照CCK-8試劑盒（CK04，日本同仁化學(xué)公司）說明書進行操作，計算細胞存活凋亡百分比。

1.8 細胞遷移實驗 采用Transwell法。下室含有FBS培養(yǎng)基，上室不含F(xiàn)BS培養(yǎng)基；待細胞遷移24 h后刮擦除去未遷移細胞。100%甲醇固定遷移細胞，0.05%結(jié)晶紫染色，在光學(xué)顯微鏡（CX23，日本OLYMPUS公司）下觀察并統(tǒng)計遷移細胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計軟件。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferoni校正的t檢驗；兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床分期CRC患者組織標(biāo)本病理學(xué)觀察及蛋白表達水平比較 Ⅳ期患者CRC組織中STAT3、p65表達明顯上調(diào)，且集中分布在細胞質(zhì)和細胞核，見圖1（插頁）。與Ⅰ期比較，Ⅲ期患者CRC組織中p-p65/p65、p-STAT3/STAT3蛋白表達水平明顯升高（均P＜0.05），見圖2。2.2 不同臨床分期CRC患者癌組織與癌旁組織細胞因子水平比較 與癌旁組織比較，Ⅱ、Ⅲ期患者癌組織中 IL-6、TNF-α 水平明顯升高（均 P＜0.05），見圖 3。

2.3 不同臨床分期CRC患者癌組織、癌旁組織與正常組織LYPD8 mRNA表達水平比較 與正常組織、癌旁組織比較，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者癌組織中LYPD8 mRNA表達水平均明顯降低（均P＜0.05）。與Ⅰ期患者癌組織比較，Ⅲ期患者癌組織中LYPD8 mRNA表達水平降低更明顯（P＜0.05），見圖 4。

2.4 LYPD8過表達對SW480細胞中IL-6、TNF-α分泌和STAT3、p65去磷酸化的影響 LYPD8 OE組中LYPD8 mRNA表達水平明顯升高，證明LYPD8過表達載體已成功用于誘導(dǎo)SW480細胞中LYPD8的過表達，見圖5a。LYPD8 OE組中IL-6、TNF-α水平均明顯降低（均P＜0.05），提示LYPD8過表達可抑制SW480細胞中IL-6、TNF-α的分泌，見圖5b。LYPD8 OE組中pp65/p65、p-STAT3/STAT3蛋白表達水平均明顯降低（均P＜0.05）；但SW480細胞培養(yǎng)基中加入5 μg/L的TNF-α或50 μg/L的IL-6時，蛋白表達水平恢復(fù)至Control組相似水平。這說明SW480細胞中LYPD8過表達可誘導(dǎo)p65、STAT3的去磷酸化，進而抑制TNF-α、IL-6的分泌。

2.5 LYPD8過表達對SW480細胞增殖的影響 LYPD8 OE組細胞存活凋亡百分比明顯低于Control組（P＜0.05）；當(dāng) SW480細胞培養(yǎng)基中加入 5 μg/L的 TNF-α或50 μg/L的IL-6時，細胞存活凋亡百分比均明顯升高（均 P＜0.05），見圖 6。

2.6 LYPD8過表達對SW480細胞遷移的影響 與未處理組、Control組比較，LYPD8 OE組細胞遷移個數(shù)明顯減少（均 P＜0.05），見圖 7（插頁）。

3 討論

在CRC組織中，大量炎癥因子促進了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。腫瘤組織與周圍炎癥微環(huán)境之間形成互動的網(wǎng)絡(luò)，可促進癌細胞生長、增殖和遷移[5]。LYPD8在結(jié)腸上皮細胞中特異性表達，而其在潰瘍性結(jié)腸炎患者的結(jié)腸上皮細胞中表達明顯降低[6]。因此，LYPD8低表達可能是結(jié)腸炎發(fā)生的重要因素，也可能是CRC發(fā)生、發(fā)展過程中的重要調(diào)節(jié)蛋白。

圖1 共聚焦激光顯微鏡下CRC組織及癌旁組織病理學(xué)觀察（CRC為結(jié)直腸癌，DAPI為4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，STAT3為信號傳導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子3，Merge為合并重疊；a：STAT3表達；b：p65表達；免疫熒光染色，標(biāo)尺100 μm）

圖2 不同臨床分期患者CRC組織中p-p65、p65、p-STAT3、STAT3、p-p65/p65及p-STAT3/STAT3蛋白表達（CRC為結(jié)直腸癌，STAT3 為信號傳導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子 3；a：p-p65、p65、p-STAT3、STAT3 蛋白表達的電泳圖；b：p-p65/p65、p-STAT3/STAT3 蛋白表達水平比較，與Ⅰ期比較，*P＜0.05）

圖3 不同臨床分期CRC患者癌組織與癌旁組織細胞因子水平比較（CRC為結(jié)直腸癌；與癌旁組織比較，*P＜0.05）

圖4 不同臨床分期CRC患者癌組織、癌旁組織與正常組織LYPD8 mRNA表達水平比較（CRC為結(jié)直腸癌，LYPD8為含有Ly6/Plaur結(jié)構(gòu)域的高度糖基化的磷脂酰肌醇錨定蛋白8；與正常組織、癌旁組織比較，*P＜0.05；與Ⅰ期癌組織比較，△P＜0.05）

IL-6是一種具有廣泛生物學(xué)功能的炎癥因子，其表達受NF-κB調(diào)節(jié)，在多個細胞中表達并參與調(diào)節(jié)腫瘤增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[7]。TNF-α在CRC患者的血清和結(jié)腸黏膜中表達增加[8]，可促進CRC的進展，其機制可能與NF-κB信號通路的激活有關(guān)[9]。本研究表明，與癌旁組織相比，CRC組織中IL-6、TNF-α水平明顯增加。STAT3相關(guān)的信號通路在各種類型癌癥（包括CRC、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌等）的發(fā)生、發(fā)展中起著正調(diào)節(jié)作用[10]。STAT3的激活可以誘導(dǎo)腫瘤細胞增殖以及腫瘤細胞凋亡和分化相關(guān)致癌基因的異常轉(zhuǎn)錄[11]。多種細胞因子（包括IL-6、TNF-α等）通過STAT3信號通路在癌細胞中發(fā)揮生物學(xué)作用[12]。IL-6通過STAT3信號通路介導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的激活，進而調(diào)控腫瘤細胞的增殖和遷移[13]。當(dāng)受到IL-6等細胞因子刺激時，STAT3的酪氨酸基團被磷酸化為p-STAT3，并通過SH2區(qū)域形成同源或異二聚體。本研究在對照組、LYPD8 OE組、LYPD8 OE+TNF-α組和LYPD8 OE+IL-6組的SW480細胞中均檢測到p-STAT3，并且LYPD8過表達可降低STAT3磷酸化。研究表明，TNF-α可激活NF-κB信號通路[14]。NF-κB是一種具有轉(zhuǎn)錄功能的蛋白質(zhì)，NF-κB的啟動涉及病理過程的基因轉(zhuǎn)錄，并有細胞因子參與[15]。NF-κB在細胞中以二聚體的形式存在，p65、p50異二聚體是其最常見的狀態(tài)，廣泛分布于細胞中，參與多種基因的表達和調(diào)控[16]。本研究結(jié)果表明，LYPD8的過表達可促進p65磷酸化，導(dǎo)致細胞行為的改變；另外發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)的癌旁組織相比，CRC組織中IL-6、TNF-α的分泌明顯增加，并誘導(dǎo)了STAT3、p65磷酸化。相反，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期CRC組織中，LYPD8的表達明顯降低。

圖5 LYPD8過表達對SW480細胞中IL-6、TNF-α分泌和STAT3、p65去磷酸化的影響（LYPD8為含有Ly6/Plaur結(jié)構(gòu)域的高度糖基化的磷脂酰肌醇錨定蛋白8，STAT3為信號傳導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子3；a：LYPD8 mRNA表達水平比較，與Control組比較，*P＜0.05；b：細胞因子水平比較，與 Control組比較，*P＜0.05；c：p-p65、p65、p-STAT3、STAT3 蛋白表達的電泳圖；d：p-p65/p65、p-STAT3/STAT3 蛋白表達水平比較，與 Control組比較，*P＜0.05）

圖6 LYPD8過表達對SW480細胞增殖的影響（LYPD8為含有Ly6/Plaur結(jié)構(gòu)域的高度糖基化的磷脂酰肌醇錨定蛋白8；與LYPD8 OE 組比較，*P＜0.05）

圖7 LYPD8過表達對SW480細胞遷移的影響（LYPD8為含有Ly6/Plaur結(jié)構(gòu)域的高度糖基化的磷脂酰肌醇錨定蛋白8；a：細胞遷移個數(shù)比較，與LYPD8 OE組比較，*P＜0.05；b：細胞遷移實驗，結(jié)晶紫染色，×200）

綜上所述，本研究與之前的研究結(jié)果共同揭示了LYPD8與IL-6/TNF-α表達之間的相關(guān)性，探索了LYPD8參與調(diào)節(jié)CRC中STAT3信號通路的機制，以及LYPD8過表達對CRC細胞行為的影響[17]。LYPD8在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者CRC組織中的表達較癌旁組織及正常組織明顯降低；LYPD8在CRC細胞中通過誘導(dǎo)STAT3、p65去磷酸化，抑制TNF-α、IL-6的分泌，從而抑制CRC細胞的增殖和遷移。本研究對闡明炎癥微環(huán)境與CRC之間的關(guān)系具有重要意義，為CRC的抗炎靶向治療的設(shè)計提供了理論和實驗依據(jù)。