黃琛斐，陳一村

(1.潮州市人民醫(yī)院中藥房，廣東 潮州 521000；2.汕頭大學醫(yī)學院藥理研究室，廣東 汕頭 515000)

海灘牽牛(Ipomoea stolonifera)是旋花科牽牛屬植物假厚藤的全草，又名白花馬鞍藤、小號馬鞍藤，主要分布于臺灣、福建、廣東等沿海地區(qū)的高潮線上的沙灘或沙丘[1-2]。海灘牽牛是潮汕地區(qū)治療風濕、類風濕關(guān)節(jié)炎的習用中藥材[3]，由于暫未作為藥材收錄于藥典中，該藥材暫無統(tǒng)一的質(zhì)量標準，且市場上藥材多經(jīng)過修治，從植物形態(tài)進行鑒別存在困難，僅能根據(jù)傳統(tǒng)的經(jīng)驗進行鑒別，存在一定的誤差，因此深化海灘牽牛的分子鑒定研究對臨床用藥安全以及規(guī)范商品市場具有深刻意義。

目前海灘牽牛的研究多關(guān)于抗炎方面的研究[4-6]，暫無DNA 條形碼等相關(guān)的檢測技術(shù)報道。常用的 DNA 條形碼有 ITS、ITS2、psbA-trnH 及matK 等。其中，ITS2 序列是去除5.8S rRNA 序列和28S rRNA 序列的核糖體DNA 序列間隔區(qū)，psbA-trnH 片段是葉綠體DNA 的轉(zhuǎn)錄非編碼序列，位于psbA基因和trnH基因之間。ITS2、psbA-trnH 等這些非編碼區(qū)相對于編碼基因在功能上的限制較少，變異程度較高，能提供較多的系統(tǒng)發(fā)育信息，且容易擴增和測序，現(xiàn)已被廣泛應用于中藥材的分子鑒定[7]。本研究運用ITS2 和psbA-trnH兩個DNA條形碼對11份海灘牽牛藥材進行鑒定，并比較這兩個序列的對海灘牽牛的鑒定能力，為海灘牽牛的質(zhì)量標準研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品從廣東潮州、揭陽、汕頭、汕尾，福建南靖、莆田等地收集的海灘牽牛樣品共11份，其中收集自福建南靖的8 號樣本經(jīng)汕頭市中心醫(yī)院藥劑科羅梓河主任基源鑒定為海灘牽牛，作為本次實驗對照組。通過BLAST 從GenBank 下載相似度高的同屬植物厚藤(Ipomoea pes-caprae)的ITS2 序列和 psbA-trnH 序列各 2 條，甘薯(Ipomoea argillicola)的 psbA-trnH 序列 1 條，11 份海灘牽牛藥材樣品產(chǎn)地見表1。

1.1.2 主要試劑和儀器廣譜性植物DNA 提取試劑盒(廣州美基生物科技公司)，ITS2、psbA-trnH序列正、反向引物由深圳華大基因科技有限公司合成，1 000×GeneGreen核酸染料(北京天根生化科技公司)，瓊脂糖(BIOWEST，西班牙)，50×TAE緩沖液(上海索寶生物科技，中國)，500 克搖擺式高速萬能粉碎機(浙江屹立工貿(mào)公司)，小型臺式高速離心機(德國 Eppendorf 公司)，Veriti96 PCR 儀(美國ABI公司)，迷你核酸水平電泳儀(北京六一生物科技公司)，凝膠成像分析儀(上海天能科技公司)。

表1 海灘牽牛樣品信息

1.2 方法

1.2.1 海灘牽牛樣品DNA提取將海灘牽牛藥材進行粉碎處理，過4號篩后精密稱取30 mg藥材粉末于2 mL的離心管中，按植物DNA提取試劑盒的操作步驟提取海灘牽牛DNA。DNA于-20°C保存。

1.2.2 ITS2 和psbA-trnH 序列擴增及測序ITS2序列正向引物為5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物為5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。psbA-trnH 序列正向引物為 5′-GTTATGCAT GAACGTAATGCTC-3′，反向引物為 5′- CGCGCA TGGTGGATTCACAATCC-3′。PCR 反應體系：2×Taq PCRMix 酶 12.5 μL，正反向引物(2.5 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，超純水10.5 μL，總體積為 25 μL。ITS2 序列擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。psbA-trnH序列擴增程序：94 °C 預變性5 min；94 °C 變性1 min；55°C退火1 min，72°C延伸1.5 min；30個循環(huán)；72°C 延伸7 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將顯示清晰且單一的電泳條帶對應的PCR擴增產(chǎn)物送深圳華大基因科技有限公司測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及分析使用BLAST 對測序結(jié)果進行比對，下載其中相似度高的序列作為后續(xù)分析數(shù)據(jù)。采用CodonCode Aligner V6.0.2 軟件對ITS2、psbA-trnH 序列的測序峰圖進行校對分析，除去低質(zhì)量區(qū)，以MEGA 6.0 軟件對所有的DNA條形碼的序列進行分析比對，計算各序列的核酸組成以及K2P 遺傳距離，構(gòu)建鄰接(neighbor-joining，NJ)進化樹，以1 000次重復的步長設置檢驗各分支的支持率。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

11份海灘牽牛樣品ITS2引物的PCR擴增和測序成功率皆為100%，擴增特異性強，條帶單一且清晰(圖1)。ITS2 序列長度為349 bp，GC平均含量為60.2%，差異位點共48個(圖2)，其中1～7號樣品的差異位點一致，共23個；8～11號樣品差異位點一致，共25 個。psbA-trnH 序列擴增結(jié)果見圖3，僅有1、3、4、8號樣品顯示清晰條帶，PCR擴增成功率為36.4%；成功擴增并測序的僅有3和4號樣品，測序成功率為18.2%，GC平均含量為13.9%。

圖1 海灘牽牛樣品ITS2序列擴增

圖2 海灘牽牛樣品ITS2序列引物差異位點圖

圖3 海灘牽牛樣品psbA-trnH序列擴增

2.2 遺傳距離分析

通過對ITS2 區(qū)遺傳距離的分析，發(fā)現(xiàn)海灘牽牛1～7號樣品為1個種屬，相互間的K2P遺傳距離為 0.00，8～11 號樣品為 1 個種屬，相互間 K2P 遺傳距離為 0.00，1～7 號樣品與 8～11 號樣品的種間遺傳距離為0.13；同屬植物厚藤的種間距離為0.01，與海灘牽牛11 個樣品的種間遺傳距離為0.34～0.55。種內(nèi)遺傳距離遠小于種間遺傳距離，即ITS2 序列能夠區(qū)分海灘牽牛和厚藤。通過對psbA-trnH 區(qū)遺傳距離的分析，發(fā)現(xiàn)海灘牽牛3～4號樣品種內(nèi)遺傳距離為0.00，厚藤種內(nèi)距離為0.78，種間距離為0.21～0.98，甘薯與厚藤2的種間遺傳距離為0.00，即psbA-trnH序列無法把不同種的厚藤與甘薯區(qū)分開。

2.3 NJ樹聚類分析

基于ITS2序列構(gòu)建的NJ樹(圖4A)表明，不同來源的海灘牽牛樣品聚為一支，能夠跟同為牽牛屬的植物(厚藤)區(qū)分開來。基于psbA-trnH 序列構(gòu)建的 NJ 樹(圖4B)表明，海灘牽牛 3～4 號樣品能夠聚為一支，但厚藤的兩個樣品無法聚為一支，而是和不同種屬植物(甘薯)聚為一支。

圖4 基于不同序列構(gòu)建的海灘牽牛、厚藤和甘薯的NJ樹

3 討論

本研究從7 個不同城市進行收集的11 份海灘牽牛實驗樣品，通過植物DNA 提取試劑盒提取總DNA，其ITS2 序列的PCR 產(chǎn)物測序成功率達100%，說明ITS2序列對于海灘牽牛的鑒定穩(wěn)定性高，是有效鑒定海灘牽牛的DNA區(qū)段。

由于海灘牽牛目前在GenBank 上暫無相關(guān)的序列片段，因此僅從GenBank 上下載相似度高的同屬植物(厚藤和甘薯)的ITS2和psbA-trnH序列共5條，與海灘牽牛樣品進行比對。通過最小遺傳距離法和基于ITS2 和psbA-trnH 序列構(gòu)建的NJ 樹都能區(qū)分海灘牽牛和其他種屬的植物，但是psbA-trnH 序列無法明確分析牽牛屬植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，而且psbA-trnH 序列在海灘牽牛中擴增和測序比較困難。本研究海灘牽牛1、8 號樣品的psbA-trnH序列測序結(jié)果顯示樣本濃度低，加量測序仍無法成功測序。對樣品DNA 提取進行了3 次重復實驗，并對PCR反應體系進行多次調(diào)整(主要是調(diào)整模板DNA 含量)，實驗結(jié)果與前期結(jié)果相同。其原因可能是受藥材的加工步驟、儲存環(huán)境和儲存時間的影響，導致了樣品中的DNA 存在不同程度的降解。同時，psbA-trnH 序列GC 含量過低也可能是該序列測序成功率低的原因。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ITS2 序列能有效鑒定海灘牽牛及同屬植物，而psbA-trnH 序列不適合作為海灘牽牛的DNA條形碼技術(shù)鑒定序列。