張基木

(中化地質(zhì)礦山總局福建地質(zhì)勘查院，福建 福州 350011)

乙酰水楊酸(Acetylsalicylic acid)又稱阿司匹林(Aspirin)是醫(yī)藥史上三大經(jīng)典藥物之一，用于臨床已有100多年，至今仍然是世界上應用最廣泛的解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎藥。近年來發(fā)現(xiàn)阿司匹林在體內(nèi)具有抗血栓的作用，它能抑制血小板的聚集，在臨床上可用于預防心腦血管疾病的發(fā)作，為該藥開辟了新的應用領域[1-2]。

口服阿司匹林后,它在肝臟或者血漿中偽膽堿酯酶的催化下迅速水解成水楊酸(Salicylic acid)，作為阿司匹林的主要活性代謝物，其主要代謝途徑有：生成甘氨酸結(jié)合物水楊尿酸(Salicyluric acid)，羥基化產(chǎn)物龍膽酸(Gentisic acid)和2,3-二羥基苯甲酸(2,3-DHBA)，還有一部分是生成葡糖苷酸的結(jié)合物。其中水楊酸、水楊尿酸、龍膽酸和2,3-二羥基苯甲酸其結(jié)構(gòu)(見圖1)均含有酚羥基，具有電化學活性，能夠用電化學檢測器來檢測。

圖1 水楊酸及其三種主要代謝物結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structural diagram of salicylic acid and its three main metabolites

目前已報道的有關體液中阿司匹林和代謝物的分離方法主要有高效液相色譜法、高效毛細管電泳和氣相色譜等幾種，常用檢測方法有紫外檢測法、熒光檢測法和質(zhì)譜法等。為了研究水楊酸和它的代謝物在動物中的排泄方式，S.Croubels等[3]開發(fā)了一種液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術。S.Zaugg等[4]建立了一種毛細管電泳與激光誘導熒光聯(lián)用方法對尿液中阿司匹林的主要代謝物(水楊酸、龍膽酸、水楊尿酸)進行分離測定。與上述方法相比，毛細管電泳電化學檢測具有樣品處理簡單，成本低廉等優(yōu)點，因此本文擬應用毛細管電泳-安培檢測聯(lián)用技術建立一種靈敏度高、快速的阿司匹林代謝物分離檢測方法，以期應用于體液分析。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

實驗室自組裝的毛細管電泳-安培檢測裝置(組件包括：±30 kV/0.3 mA 無極可調(diào)高壓電源)，上海原子核研究所；未涂層石英毛細管(φ25 μm×60 cm)，河北永年光纖廠；三電極工作系統(tǒng)；BAS LC-4C型安培檢測器(Bioanalytical System, West Lafayetle, In, USA)、HW-2000色譜工作站,南京千譜軟件有限公司；CHI 660A 電化學工作站，上海辰華儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，Millipore，Bedford，USA；PHS-2C型精密酸度計，上海雷磁儀器廠；KQ-100型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

水楊酸(Salicylic acid，SA)、龍膽酸(Gentisic acid，GA)、和2,3-二羥基苯甲酸(2,3-DHBA)均購自百靈威；水楊尿酸(Salicyluric acid，SU)由Sigma公司購得。試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

1.2 電泳條件

未使用過的毛細管先用1 mol/L的NaOH溶液活化2 h，再用Milli-Q超純水沖洗30 min。每日試驗前，毛細管用0.1 mol L-1的NaOH洗10 min、水洗10 min、緩沖液洗5 min以保證遷移時間的重現(xiàn)性。緩沖液和樣品溶液在測定前需用0.22 μm濾膜過濾，并用超聲儀除氣泡。

分離條件：40 mmol·L-1pH 9.2硼酸-硼砂緩沖液為運行緩沖液；電動進樣18 kV(12 s)；分離電壓18 kV，檢測電位+0.95 V，所有實驗都在25 ℃室溫下進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 循環(huán)伏安實驗(CV)

從圖2我們可以清楚的看到這四種代謝物都有電化學活性，GA和2,3-DHBA的氧化峰電位較低，分別為0.3 V和0.4 V，SU氧化峰電位在0.7～0.8 V之間，SA的氧化電位較高，在0.95 V左右。因此我們初步選定工作電極的電位為0.95 V。

圖2 四種代謝物的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammetry of four metabolites

2.2 四種代謝物分離條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測電位的優(yōu)化

在CE-AD中，加在工作電極上的電位直接影響檢測的靈敏度和檢測限，因此，考察了這四種代謝物在毛細管電泳體系中的流體動力學伏安圖。如圖3所示，在+0.7～ +1.0 V(vs. Ag/AgCl)范圍內(nèi)考察了不同的檢測電位對四種代謝物的響應情況的影響。從圖中可以看出，SA在電位為0.70 V時，峰電流幾乎為零，電位增加時，峰電流急速升高。GA和2,3-DHBA在0.70～0.85 V范圍內(nèi)隨電位升高峰電流迅速增加，到0.9 V時峰電流基本達到最大值，繼續(xù)增加電位，其峰電流反而下降。SU的峰電流隨著電位升高而增加，并在1.0 V時趨于平緩。而且實驗過程中發(fā)現(xiàn)，在pH=9.2，濃度為40 mM的硼酸-硼砂緩沖液中，檢測電位為+0.95 V時基線較平穩(wěn)，檢測器對各待測組分的檢測靈敏度均較高，繼續(xù)提高檢測電位，基線電流會急劇上升，致使信噪比下降。綜合以上因素，最終選擇0.95 V為最佳工作電位。

圖3 四種代謝物的流體力學伏安圖Fig.3 Voltammetric diagram of four metabolites

2.2.2 緩沖液的影響

(1)緩沖液類型的選擇

緩沖液是各種組分運行的載體，緩沖液的類型不僅影響到EOF，而且直接影響到粒子的遷移和組分最后的分離效果。本實驗考察了磷酸鹽、硼酸鹽、Tris-HCl三種緩沖液對分離的影響，結(jié)果表明，在硼酸-硼砂緩沖液中四種待測組分的響應最好，分離效果最好，因此我們選擇了硼酸-硼砂緩沖體系為最佳電泳運行液。

(2)緩沖液pH值的影響

緩沖液pH的改變，除影響溶質(zhì)本身的電荷外，還會引起電滲流的相應變化。本文在選定的硼酸-硼砂緩沖體系中，考察了pH在8.0～10.0范圍內(nèi)，對四種代謝物的分離效果的影響。如圖4所示，四種代謝物的遷移時間隨著pH增大而增加，當pH=8.8時SA跟2,3-DHBA不能分開，隨著pH值的提高，分離度逐漸得到改善，pH為9.2時達到完全基線分離。但是隨著pH值再增加GA與SA逐漸靠近，不能達到基線分離。綜合考慮到峰形、分離度等原因，實驗選擇pH 9.2作為最佳pH值。

圖4 緩沖液pH對四種代謝物分離的影響Fig.4 Effect of buffer pH on separation of four metabolites

(3)緩沖液濃度的影響

緩沖液濃度增大，緩沖介質(zhì)的離子強度隨之增加，雙電層的Zeta電勢減小，電滲流速降低，分離度得到改善，遷移時間延長。但是較高濃度的緩沖液常常會導致很高的管電流，產(chǎn)生大量焦耳熱，使得基線升高，靈敏度降低，而濃度太低，則起不了緩沖液的緩沖作用。本文考察了硼酸-硼砂緩沖液濃度分別為10、20、30、40、50 mM時，濃度對遷移時間及峰電流的影響。從圖5可以看出，當濃度低于10 mM時SA和2,3-DHBA不能基線分離，隨著濃度增加，分離度提高，遷移時間變長。當濃度大于40 mM時，背景電流明顯增大，基線噪音上升，GA和2,3-DHBA峰電流降低(見圖6)，峰形展寬。綜合分析時間、峰電流等因素，實驗選擇40 mM硼酸-硼砂緩沖液(pH 9.2)為運行緩沖液。

圖5 緩沖液濃度對遷移時間的影響Fig.5 Effect of buffer concentration on migration time

圖6 緩沖液濃度對峰電流的影響Fig.6 Effect of buffer concentration on peak current

2.2.3 分離電壓和進樣時間的選擇

分離電壓的改變主要影響組分的遷移時間和分離效果兩方面因素。分離電壓越高，樣品的遷移時間越短，但分離效果不如電壓較低時好，而且電場對工作電極的干擾增大。若分離電壓太低，樣品的遷移時間過長，峰形也會有所展寬，峰電流降低。本文考察了14～20 kV之間的分離電壓對遷移時間的影響，結(jié)果(圖7)表明在這個范圍內(nèi)四種代謝物均能得到很好基線分離。而且隨著分離電壓的增加，遷移時間縮短，在一定范圍內(nèi)檢測靈敏度也相應增加。但當分離電壓大于18 kV時，基線噪音增大，為了保證最佳的分離度和遷移時間，最終選擇18 kV為最優(yōu)分離電壓。

圖7 分離電壓對遷移時間的影響Fig.7 Effect of separation voltage on migration time

在毛細管區(qū)帶電泳中，進樣時間的長短不僅影響進樣量的多少，而且在一定程度上也影響著峰形。在18 kV條件下，本實驗研究了進樣時間分別為6，8，10，12，14 s時的分離情況，測定四種物質(zhì)的峰高和進樣時間的關系(圖8),從圖中可以看出，峰電流隨著進樣時間的增加迅速增加，當進樣時間超過12 s后峰電流增加不明顯，而且引起峰展寬、拖尾等影響。故選擇12 s為最優(yōu)進樣時間。

圖8 進樣時間與峰電流關系圖Fig.8 Relationship between injection time and peak current

2.3 阿司匹林四種代謝物的毛細管電泳分離行為

經(jīng)過一系列影響因素的優(yōu)化后，在40 mmol/L 硼酸-硼砂運行緩沖液(pH 9.2)中，從毛細管陽極端電動進樣18 kV(12 s)，采用分離電壓18 kV, 對阿司匹林四種代謝物進行CZE分離。柱端安培檢測池為陰極電泳槽，采用三電極系統(tǒng)(碳圓盤電極，Pt對電極，Ag/AgCl參比電極)檢測，工作電位+1.0 V(vs.Ag/AgCl)，記錄的CZE電泳譜圖見圖9。

圖9 四種代謝物標準溶液的毛細管電泳圖Fig.9 Capillary electrophoresis patterns of four metabolite standard solutions

3 結(jié) 論

本文采用毛細管電泳安培檢測方法進行阿司匹林代謝物分離檢測研究，在最優(yōu)條件下8 min內(nèi)實現(xiàn)了對四種阿司匹林主要代謝物的基線分離。該方法靈敏、操作成本低、所需樣品、溶劑用量極微，實驗結(jié)果令人滿意，有望用于血清，尿液等實際樣品的測定。