張素玲，吳 芃，岳亞男，白晨雨，郝麗影，李向東，逄文強(qiáng)，田克恭

(國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471003)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一種高致死性傳染病。ASFV具有雙層囊膜結(jié)構(gòu)，基因組大小約180～190 kb[1]，編碼160多種蛋白質(zhì)，其中50多種為病毒結(jié)構(gòu)蛋白[2-3]。

ASFV基因組包含幾個不同的多基因家族，其中MGF360和MGF505位于基因組高度可變的左端區(qū)域，由其編碼的蛋白質(zhì)對ASFV的復(fù)制及感染均具有重要的影響[4-7]。ASFV編碼的多基因家族能夠抑制感染的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型IFN應(yīng)答，MGF360和MGF530/505等多個基因缺失后，可導(dǎo)致Ⅰ型IFN在感染巨噬細(xì)胞中的誘導(dǎo)水平增加，且缺失后的毒株對Ⅰ型IFN敏感，表明這些基因具有抑制IFN應(yīng)答和抗病毒狀態(tài)的功能[8-9]。敲除ASFV強(qiáng)毒株MGF360和MGF505/530中的多個基因后，病毒在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制能力未受影響，但對家豬的致病力發(fā)生降低；該毒株免疫后能夠針對親本毒株提供較好的攻毒保護(hù)，其保護(hù)水平和免疫劑量、親本毒株類型和缺失的基因有關(guān)[10-12]。上述研究均表明，以多基因家族為靶點的基因缺失疫苗研制是ASFV免疫防控的重要方向之一。因此，體外表達(dá)具有生物學(xué)活性的MGF蛋白和制備相應(yīng)的單克隆抗體或多克隆抗體成為免疫學(xué)診斷方法建立的前提。

大腸桿菌是用于外源蛋白表達(dá)的常用宿主菌株，但是表達(dá)的外源蛋白易形成包涵體，不具有生物活性。利用能夠增強(qiáng)重組蛋白可溶性表達(dá)的融合標(biāo)簽SUMO[13-14]、TrxA[15]、GST[16]、MBP[17]和NusA[18]可以提高外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)水平。鑒于此，通過標(biāo)簽篩選、優(yōu)化表達(dá)和純化條件，以獲得高純度可溶性ASFV MGF505-5R蛋白，并制備特異性的多克隆抗體，旨在為ASFV基因缺失疫苗的免疫學(xué)鑒別診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

質(zhì)粒pET28a購自Novagen公司；菌株DH5α、E.coliBL21(DE3)均購自天根生化科技(北京)有限公司；質(zhì)粒pET28a-SUMO、pET28a-TrxA、pET28a-GST、pET28a-MBP、pET28a-NusA均為國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心構(gòu)建。

1.2 主要試劑

DL2000 Marker、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶均購自Thermo Fisher公司；2×EasyTaqPCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白質(zhì)預(yù)染Marker購自Thermo Fisher公司；Ni2+親和層析填料、MBP親和層析柱均購自美國GE Healthcare公司；羊抗鼠IgG-HRP二抗購自Abbkine公司；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 基因的擴(kuò)增及重組表達(dá)載體的構(gòu)建 經(jīng)過密碼子優(yōu)化的MGF505-5R基因由金唯智合成。根據(jù)合成的基因設(shè)計1對特異性引物，F(xiàn)：5′-CGCGGATCCATGTTCTCTCTGCAGGAAAT-3′；R：5′-CCGCTCGAGTTATTCGTAACGCATGTCGG-3′，其中下劃線位置為酶切位點。以合成的MGF505-5R基因為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收。將回收的MGF505-5R片段和pET28a載體同時用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切后回收，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建pET28a-MGF505-5R載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將菌液均勻涂布于含卡那霉素(100 mg/mL)LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定并送金唯智進(jìn)行測序。以國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心前期構(gòu)建的pET28a-SUMO、pET28a-TrxA、pET28a-GST、pET28a-MBP和pET28a-NusA5個質(zhì)粒為模板，利用表1中的引物分別PCR擴(kuò)增His-SUMO、His-TrxA、His-GST、His-MBP和His-NusA基因片段并回收。將回收的5個片段分別用NdeⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切后回收，然后分別與NdeⅠ和BamHⅠ酶切后的pET28a-MGF505-5R載體連接，構(gòu)建pET28a-SUMO-MGF505-5R、pET28a-TrxA-MGF505-5R、pET28a-GST-MGF505-5R、pET28a-MBP-MGF505-5R和pET28a-NusA-MGF505-5R表達(dá)載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素(100 mg/mL)LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定并送金唯智進(jìn)行測序，將5種測序正確的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

表1 引物序列

1.3.2 重組蛋白表達(dá)與可溶性分析 將5種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過夜后挑取單克隆菌落接種于含有100 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床(220 r/min)過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)過夜的種子按1%的接種量接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖床(220 r/min)培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6時，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，分別在20 ℃和28 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)10 h。表達(dá)結(jié)束后，離心收集菌體細(xì)胞。按照菌體∶重懸液=1∶10的比例加入PBS，充分重懸菌體細(xì)胞。超聲破碎后，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，采用灰度掃描分析法分析重組蛋白表達(dá)水平和可溶性。根據(jù)初步表達(dá)結(jié)果，選擇可溶性表達(dá)較好的菌株進(jìn)行誘導(dǎo)劑含量和誘導(dǎo)時間的優(yōu)化，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測分析。

1.3.3 重組蛋白的純化 取pET28a-MBP-MGF505-5R轉(zhuǎn)化的E.coliBL21(DE3)按照優(yōu)化的表達(dá)條件大量誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)后的菌體加PBS重懸后，800 bar高壓均質(zhì)破碎。破碎后的樣品4 ℃、12 000 r/min離心1 h，取上清用0.45 μm濾膜過濾后，分別用Ni2+親和層析和MBP親和層析進(jìn)行純化。Ni2+親和層析用咪唑梯度進(jìn)行洗雜和洗脫，MBP親和層析選用麥芽糖梯度進(jìn)行洗雜和洗脫。收集的洗脫蛋白用PBS緩沖液透析后，加入TEV蛋白酶將MBP標(biāo)簽蛋白切除，然后加入Ni2+填料，4 ℃過夜孵育吸附MBP標(biāo)簽蛋白，離心取上清用12% SDS-PAGE檢測。

1.3.4 動物免疫 MGF505-5R蛋白與弗氏完全佐劑按1∶1混合后乳化，以每只小鼠100 μg的劑量對6周齡雌性BALB/c小鼠進(jìn)行皮下免疫；以弗氏不完全佐劑充分乳化MGF505-5R蛋白，并按相同方式和劑量于21、42、63 d進(jìn)行免疫。最后一次免疫結(jié)束后7 d采血，分離血清，采用間接ELISA法檢測免疫血清的抗體效價。

1.3.5 重組蛋白的Western blot分析 純化后的MGF505-5R蛋白電泳后，采用半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，含5%脫脂牛奶粉的封閉液25 ℃封閉2 h，然后加入1∶500稀釋的鼠抗MGF505-5R蛋白血清，4 ℃孵育過夜后棄去，PBST反復(fù)洗滌3次。再加入1∶5 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP二抗，室溫孵育1 h后棄去，PBST反復(fù)洗滌3次。用DAB顯色試劑盒顯色后，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 MGF505-5R重組載體的構(gòu)建與鑒定

以合成的MGF505-5R基因為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1，從圖1可以看出，擴(kuò)增的MGF505-5R基因片段大小約為1 500 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。MGF505-5R基因片段與pET28a載體連接的質(zhì)粒測序結(jié)果正確，表明pET28a-MGF505-5R載體構(gòu)建成功。分別以國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心前期構(gòu)建的5種質(zhì)粒為模板，利用表1中的引物分別擴(kuò)增5種融合標(biāo)簽蛋白的基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，His-SUMO基因、His-TrxA基因、His-GST基因、His-MBP基因和His-NusA基因片段大小分別約為350、300、700、1 000 bp和1 500 bp，均與預(yù)期基因片段大小相符。將5種重組質(zhì)粒分別測序，測序結(jié)果與模板堿基序列一致，表明重組表達(dá)載體pET28a-SUMO-MGF505-5R、pET28a-TrxA-MGF505-5R、pET28a-GST-MGF505-5R、pET28a-MBP-MGF505-5R和pET28a-NusA-MGF505-5R均構(gòu)建成功。

M：DL2000 Marker；1：MGF505-5R基因

M：DL2000；1：His-SUMO基因；2：His-TrxA基因；3：His-GST基因；4：His-MBP基因；5：His-NusA基因

2.2 MGF505-5R重組蛋白表達(dá)與可溶性分析

分別取5種菌株表達(dá)的上清和沉淀20 μL，加入5 μL 5×Loading Buffer，沸水加熱10 min，進(jìn)行SDS-PAGE檢測分析。從圖3可以看出，28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)時，5種菌株均大量表達(dá)重組蛋白，但是均為包涵體；20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)時，SUMO-MGF505-5R、GST-MGF505-5R和TrxA-MGF505-5R重組蛋白仍為不溶性的包涵體，NusA-MGF505-5R和MBP-MGF505-5R重組蛋白可溶性表達(dá)水平提高，其中MBP-MGF505-5R蛋白的可溶性表達(dá)水平經(jīng)過灰度掃描分析可知提高約20%。

A：重組蛋白28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果(M：蛋白質(zhì)Marker；1、3、5、7、9、11分別為28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)后的全菌裂解上清；2、4、6、8、10、12分別為28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)后的全菌裂解沉淀)；B：重組蛋白20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果(M：蛋白質(zhì)Marker；1、3、5、7、9、11分別為20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)后的全菌裂解上清；2、4、6、8、10、12分別為20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)后的全菌裂解沉淀)

對MBP-MGF505-5R重組蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，即在20 ℃條件下，設(shè)置IPTG濃度梯度：0.2、0.5、0.8 mmol/L，分別誘導(dǎo)8 h和12 h取樣檢測分析MBP-MGF505-5R重組蛋白可溶性表達(dá)水平。從圖4可以看出，當(dāng)IPTG濃度為0.5 mmol/L時，MBP-MGF505-5R重組蛋白可溶性表達(dá)量最高，但是進(jìn)一步增加誘導(dǎo)劑濃度到0.8 mmol/L時，MBP-MGF505-5R重組蛋白可溶性表達(dá)水平下降，說明最適誘導(dǎo)劑濃度為0.5 mmol/L。在IPTG濃度為0.5 mmol/L的誘導(dǎo)條件下，誘導(dǎo)時間增加，MBP-MGF505-5R重組蛋白的可溶性表達(dá)量提高。

A：重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)8 h結(jié)果(M：蛋白質(zhì)Marker；1、3、5分別為IPTG濃度為0.2、0.5、0.8 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)8 h后的全菌裂解上清；2、4、6分別為IPTG濃度為0.2、0.5、0.8 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)8 h后的全菌裂解沉淀)；B：重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)12 h結(jié)果(M：蛋白質(zhì)Marker；1、3、5分別為IPTG濃度為0.2、0.5、0.8 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)12 h后的全菌裂解上清；2、4、6分別為IPTG濃度為0.2、0.5、0.8 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)12 h后的全菌裂解沉淀)

2.3 MBP-MGF505-5R重組蛋白的純化

MBP-MGF505-5R重組蛋白N端含有6×His融合標(biāo)簽，可以利用MBP 親和層析和Ni2+親和層析進(jìn)行純化。為了獲得純度較高的目的蛋白，分別進(jìn)行上述2種純化試驗。洗脫的MBP-MGF505-5R重組蛋白12%進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果(圖5A)顯示，目的蛋白分子質(zhì)量約為100 ku?；叶葤呙璺治鼋Y(jié)果顯示，Ni2+親和層析純化后純度約為80%，MBP親和層析純化后純度大于90%。去除MBP標(biāo)簽后，經(jīng)12% SDS-PAGE檢測，結(jié)果(圖5B)顯示，MGF505-5R分子質(zhì)量約為55 ku。

A：MBP-MGF505-5R重組蛋白的純化(M：蛋白質(zhì)Marker；1：MBP親和層析純化MBP-MGF505-5R重組蛋白；2：Ni2+親和層析純化MBP-MGF505-5R重組蛋白)；B：MGF505-5R蛋白的純化(M：蛋白質(zhì)Marker；1：MGF505-5R蛋白)

2.4 MGF505-5R蛋白多克隆抗體的制備

用純化后的MGF505-5R蛋白免疫小鼠后，采集并分離小鼠血清進(jìn)行間接ELISA檢測血清效價，結(jié)果顯示，免疫后的小鼠血清效價達(dá)到1∶12 800以上，表明MGF505-5R蛋白活性良好，具有免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。

2.5 MGF505-5R蛋白的生物活性分析

Western blot結(jié)果顯示，PVDF膜上出現(xiàn)了分子質(zhì)量約為55 ku的特異性條帶，表明MGF505-5R蛋白活性良好，且免疫小鼠后能產(chǎn)生特異性抗體(圖6)。

M：蛋白質(zhì)Marker；1：MGF505-5R蛋白

3 結(jié)論與討論

ASFV基因組可編碼多種蛋白質(zhì)，用于調(diào)控宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)、干擾宿主天然免疫系統(tǒng)和調(diào)控細(xì)胞周期等，從而抑制和逃避宿主的免疫應(yīng)答，其中ASFV編碼的免疫逃避蛋白MGF360和MGF505/530是基因缺失疫苗研制的主要靶標(biāo)之一。KING等[19]將ASFV弱毒株OURT88/3進(jìn)行了部分MGF基因的缺失，與親本病毒相比，MGF基因缺失毒株可以誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的IFN，且可提供針對同源病毒的保護(hù)力。因此，多基因家族基因缺失疫苗有望應(yīng)用于臨床，成為預(yù)防非洲豬瘟的商業(yè)化疫苗。吳映彤[20]建立了針對MGF360-12L和MGF360-13L的分子檢測方法，并利用大腸桿菌原核表達(dá)載體對MGF360-12L和MGF360-13L蛋白進(jìn)行了表達(dá)，并對表達(dá)的MGF360-12L和MGF360-13L包涵體蛋白進(jìn)行了純化，為多克隆抗體的制備和間接ELISA檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。包涵體蛋白因其空間結(jié)構(gòu)不正確，可能不具有生物學(xué)活性。因此，利用具有生物學(xué)活性的多基因家族蛋白制備相應(yīng)的單克隆抗體或多克隆抗體，對多基因家族基因缺失疫苗的免疫學(xué)鑒別診斷具有重要意義。

本研究選用原核表達(dá)系統(tǒng)，通過標(biāo)簽篩選成功獲得了可溶性的ASFV MBP-MGF505-5R重組蛋白，并利用純化后的MGF505-5R蛋白免疫小鼠制備了特異性的多克隆抗體。ASFV強(qiáng)毒或弱毒株缺失MGF360和MGF530/505基因后免疫動物，可以提供針對同源病毒或部分異源病毒的攻毒保護(hù)[21-22]。因此，本研究制備的多克隆抗體有望用于ASFV MGF505相關(guān)基因缺失疫苗的臨床免疫學(xué)鑒別檢驗，為進(jìn)一步建立鑒別診斷方法奠定了基礎(chǔ)。