趙彥玲，李善政，王福成，王建洲，任子利

(西藏農(nóng)牧學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000)

DNA甲基化在調(diào)節(jié)基因表達、基因組穩(wěn)定性和細胞命運承諾方面起著關(guān)鍵作用[1],在哺乳動物精子發(fā)生過程中也發(fā)揮著重要作用[2]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a(Dnmt3a)是主要的從頭甲基化酶之一，其表達水平會影響到全基因組DNA甲基化的水平，從而調(diào)控基因表達[3]。藏豬是我國特有的能適應(yīng)高原環(huán)境的一個重要品種[4],其雄性生殖系統(tǒng)已適應(yīng)高海拔條件[5]。對藏豬Dnmt3a基因進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)篩選并分析其在精子中的表達，有助于高繁殖力藏豬的分子育種等工作的開展。LIU等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Dnmt3a啟動子多態(tài)性與輔助生殖技術(shù)和自然受孕后的人類自然流產(chǎn)風(fēng)險相關(guān)。波蘭人群中Dnmt3a基因變異與卵巢癌風(fēng)險有關(guān)[7]。ZENG等[8]采用qRT-PCR和ELISA方法對新鮮和超低溫保存的豬精子中Dnmt3a的mRNA表達和蛋白質(zhì)水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)該基因在超低溫保存后的精子中，其mRNA表達水平顯著低于新鮮精子，而蛋白質(zhì)表達水平差異不顯著。筆者所在課題組研究了Dnmt3a在藏豬與大白豬睪丸中的mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)藏豬睪丸組織中，Dnmt3a基因mRNA相對表達量顯著低于大白豬[9]。有研究表明，Dnmt3a敲除小鼠的精子發(fā)生受損并出現(xiàn)異常的父系印跡[10]。Dnmt3a基因?qū)诱０l(fā)生至關(guān)重要[11]，但目前尚未見對藏豬Dnmt3a基因進行SNP篩選并分析其在精子中表達的研究。因此，采用PCR-直接測序法對藏豬Dnmt3a基因5′側(cè)翼區(qū)和編碼區(qū)進行SNP篩選，分別應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)、Westen blot方法對藏豬Dnmt3a基因在精子中的mRNA、蛋白質(zhì)表達水平進行研究，旨在為闡述藏豬精子高原適應(yīng)性的DNA甲基化機制及高繁殖力藏豬的分子育種等研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集及處理 采集藏豬、大白豬和滇南小耳豬各50個個體的耳組織以篩選Dnmt3a基因的SNP。藏豬、大白豬的精液分別取自西藏農(nóng)牧學(xué)院實習(xí)基地與西藏林芝嘎瑪養(yǎng)殖有限責(zé)任公司。用手握法分別采集10頭健康藏豬、大白豬精液，取中段精液，3層紗布過濾，將精子活率在80%以上的精液放入保溫瓶立即運回實驗室。將精液在4 ℃條件下2 000 r/min離心10 min，分離出精子細胞。用預(yù)冷的PBS溶液重懸精子細胞，再次離心10 min進行洗滌，重復(fù)2次。將洗滌后的精子立即用于總RNA及蛋白質(zhì)提取或存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生物技術(shù)有限公司；2×TaqPCR Mix購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；TransStart Eco Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Trizol、蛋白質(zhì)抽提試劑、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(增強型)、抗體稀釋液、封閉液、ECL底物發(fā)光顯色試劑盒、蛋白質(zhì)Marker、β-actin小鼠單克隆抗體、Dnmt3a兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)等均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

PCR儀、Eppendorf Centrifuge 5417R、5415R離心機購自德國Eppendorf公司；Boi-Rad凝膠成像系統(tǒng)、CFX96熒光定量實時PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

從GenBank中獲得豬Dnmt3a基因cDNA序列(NM_001097437)和5′側(cè)翼區(qū)2 500 bp的DNA序列，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計8對引物，可以擴增該基因cDNA和5′側(cè)翼區(qū)2 500 bp的DNA序列，引物信息見表1。

表1 豬Dnmt3a基因SNP篩選引物信息

從GenBank中獲得豬Dnmt3a和β-actin基因的cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件跨內(nèi)含子設(shè)計這2個基因的定量引物，用于實時熒光定量PCR擴增,引物信息見表2。引物由生工生物工程(北京)股份有限公司合成。

表2 實時熒光定量PCR的引物信息

1.3 組織DNA和RNA提取

1.3.1 DNA提取 用苯酚-氯仿抽提法提取精子(藏豬、大白豬)與耳組織(藏豬、大白豬、滇南小耳豬，打耳標時取樣)的基因組DNA。

1.3.2 RNA提取及cDNA合成 采用Trizol一步法提取豬精子及耳組織的總RNA，質(zhì)檢合格后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Dnmt3a基因SNP篩選

1.4.1 PCR擴增 PCR反應(yīng)體系:模板1 μL，2×TaqPCR Mix 10 μL，正向和反向引物各0.4 μL，加ddH2O至20 μL。PCR的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸50 s，38個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，降溫至4 ℃保存。

1.4.2 SNP分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，每個品種選取擴增效果最優(yōu)的10個樣本，每個樣本取5 μL PCR產(chǎn)物，混池后送生工生物工程(北京)股份有限公司測序。測序結(jié)果利用軟件DNAMAN和Chromas進行峰圖比對分析,篩選出SNP位點，然后對藏豬、大白豬、滇南小耳豬這3個豬種各50個個體進行個體測序，以確定個體SNP位點的基因型。

1.5 Dnmt3a基因?qū)崟r熒光定量PCR

1.5.1 PCR擴增 藏豬、大白豬精子中Dnmt3a和β-actin基因的PCR反應(yīng)體系同1.4.1。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；然后95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，36個循環(huán)；72 ℃延伸7 min, 最后4 ℃結(jié)束反應(yīng)。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.5.2 標準曲線的制備及實時熒光定量PCR 將反轉(zhuǎn)錄得到的所有樣本的cDNA分別取出2 μL混合在一起成為熒光定量PCR的校準樣，將校準樣按5倍梯度進行稀釋，共稀釋5個梯度(包括原校準樣)，在伯樂CFX96實時熒光定量PCR儀上運行標準曲線的程序，程序結(jié)束后看其標準曲線的斜率和引物擴增效率，若擴增效率PCR在90%～105%，說明引物可用于實時熒光定量PCR。

每個樣本的目的基因和內(nèi)參基因均在同一板擴增，且設(shè)目的基因與內(nèi)參基因的校準樣擴增，均設(shè)3個重復(fù)，以這3個重復(fù)Ct值的平均值作為該個體的平均Ct值。反應(yīng)程序：95 ℃ 15 min，40個循環(huán)(95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，然后95 ℃ 10 s，65 ℃至95 ℃每增加0.5 ℃讀取熒光1次，繪制熔解曲線。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系同1.4.1。目的基因的表達量采用2-ΔΔCT法計算。

1.6 Dnmt3a蛋白表達水平檢測

1.6.1 精子總蛋白質(zhì)的提取與定量 分別在藏豬、大白豬精子中加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑，勻漿2次，在4 ℃條件下14 000 r/min離心30 min,取上清液,按照BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(增強型)說明書提供的方法，測定樣品總蛋白質(zhì)的濃度，用于進行后續(xù)試驗或置于-80 ℃冰箱備用。

1.6.2 Westen blot方法檢測Dnmt3a蛋白表達水平 每個樣品均取30 μg總蛋白質(zhì)，變性上樣后，進行SDS-PAGE電泳，然后將分離膠轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉液4 ℃封閉過夜，洗膜后根據(jù)Marker標記的位置將膜橫向剪開，分別放入各自稀釋好(1∶1 000)的一抗(β-actin小鼠單克隆抗體、Dnmt3a兔單克隆抗體)中,于搖床上室溫孵育2～4 h，洗膜后放入各自稀釋好(1∶1 000)的二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L))中，于搖床上室溫孵育2 h，再洗膜后用ECL顯影。用Image J圖像分析軟件對條帶進行灰度值計算，蛋白質(zhì)相對表達量為Dnmt3a與β-actin灰度值的比值。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

基因表達量和蛋白質(zhì)表達量數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，結(jié)果用平均數(shù)±標準誤表示，差異顯著性水平為P<0.05。用Sigma Plot 10.0軟件對Dnmt3a基因的mRNA及蛋白質(zhì)表達水平進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Dnmt3a基因5′側(cè)翼區(qū)與外顯子區(qū)的SNP篩選

由圖1、表3可知，在藏豬Dnmt3a基因的5′側(cè)翼區(qū)起始密碼子上游2 012 bp處發(fā)現(xiàn)1個C→T的突變，且雜合度、多態(tài)信息含量均較高，表明群體內(nèi)變異程度大、能提供的遺傳信息較多，但該位點不是藏豬特有的SNP，滇南小耳豬也有。在編碼區(qū)，藏豬Dnmt3a基因的第11外顯子區(qū)第1 360 bp處發(fā)現(xiàn)1個C→T突變位點，且該位點在大白豬、滇南小耳豬均未突變，但該突變并沒有引起氨基酸變化，原來的GCC翻譯成丙氨酸，突變后變成GCT，也翻譯成丙氨酸，屬同義突變，且雜合度、多態(tài)信息含量均較低，表明群體內(nèi)變異程度小、能提供的遺傳信息較少。

YP：大白豬；DP：滇南小耳豬；TP：藏豬，下同

表3 Dnmt3a基因SNP的基因型及基因頻率

2.2 藏豬精子中Dnmt3a基因mRNA表達水平

在β-actin、Dnmt3a的標準曲線擴增中，其擴增效率在90%～105%，R2值均大于0.99，且沒有非特異性擴增，符合試驗的質(zhì)量控制要求。從圖2可以看出，Dnmt3a基因在藏豬精子中的mRNA表達水平顯著低于大白豬(P<0.05)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.3 藏豬精子中Dnmt3a蛋白表達水平

Dnmt3a蛋白在藏豬、大白豬精子的蛋白質(zhì)印跡中均有清晰的條帶(圖3A)，藏豬精子中Dnmt3a蛋白的相對表達量顯著低于大白豬(P<0.05,圖3B)。

A.蛋白質(zhì)印跡；B.蛋白質(zhì)表達水平

3 結(jié)論與討論

本研究中，在藏豬Dnmt3a基因的5′側(cè)翼區(qū)和外顯子區(qū)各發(fā)現(xiàn)了1個SNP。在5′側(cè)翼區(qū)起始密碼子上游2 012 bp處，發(fā)現(xiàn)C→T的突變，且雜合度、多態(tài)信息含量均較高，表明群體內(nèi)變異程度大，能提供的遺傳信息較多。在藏豬Dnmt3a基因的第11外顯子區(qū)第1 360 bp處也發(fā)現(xiàn)了C→T突變位點，且是大白豬和滇南小耳豬所沒有的SNP，但突變前后都翻譯成丙氨酸，屬同義突變，且雜合度、多態(tài)信息含量均較低，表明群體內(nèi)變異程度小，能提供的遺傳信息較少?？梢?，C2 012T位點可以作為藏豬分子育種中的候選標志。

本研究中，Dnmt3a基因在藏豬精子中的mRNA與蛋白水平上的相對表達量均顯著低于大白豬，這有助于闡明藏豬精子高原適應(yīng)性的DNA甲基化機制[12]。Dnmt3a在高畸形率的人精子中mRNA表達水平顯著高于正常精子[13]，其在小鼠生殖系干細胞中的異常表達會導(dǎo)致精子形成缺陷[14]，人源性Dnmt3a在轉(zhuǎn)基因大鼠睪丸中過表達會提高大鼠精子全基因組DNA甲基化水平[15]。藏豬睪丸組織中，Dnmt3a基因mRNA相對表達量顯著低于大白豬[9]。本研究中，藏豬精子的Dnmt3a基因mRNA相對表達量也顯著低于大白豬，而BAN等[16]認為，Dnmt3a在藏豬肺中的mRNA表達水平顯著高于大白豬，造成結(jié)果的不同可能與所檢測的組織不同有關(guān)。在低氧條件下，Dnmt3a介導(dǎo)的DNA甲基化改變會調(diào)節(jié)成骨分化[17]，Dnmt3a過表達可通過p21和PPARg啟動子甲基化促進豬肌肉前脂肪細胞增殖并抑制其分化[18]，Dnmt3a蛋白在睪丸細胞和生長受阻的成纖維細胞中呈高水平[19]，阿霉素能降低Dnmt3a在睪丸中的表達水平[20]。雄性不育的犏牛睪丸組織中Dnmt3a蛋白的相對表達量顯著高于牦牛[21]，這與本研究結(jié)果一致，藏豬精子的Dnmt3a蛋白表達水平顯著低于大白豬，有利于藏豬精子品質(zhì)的提高。

綜上，相對于大白豬，藏豬Dnmt3a基因C2 012T位點可以作為藏豬分子育種中的候選標志；藏豬精子中Dnmt3a基因mRNA及蛋白的低表達可能會導(dǎo)致較低的基因組DNA甲基化水平，從而有利于轉(zhuǎn)錄，這可能是藏豬精子高原適應(yīng)性的DNA甲基化機制之一，而如何進一步闡明藏豬精子高原適應(yīng)性的DNA甲基化機制、開展高繁殖力藏豬的分子育種等研究是今后研究的方向。