超表達(dá)桃樹PpADC基因?qū)е路寻屯砘ㄑ芯?/h1>
2020-10-17 14:33:10王保全張曉娜李國(guó)懷
河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年10期 關(guān)鍵詞：植物
王保全，張曉娜，李國(guó)懷
(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)
多胺(PAs)是一類具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿，廣泛存在于原核和真核生物體中。植物體內(nèi)具有重要生物功能的多胺主要有腐胺(Put)、精胺(Spm)和亞精胺(Spd)等[1-2]。多胺參與植物種子形成、器官發(fā)育、果實(shí)成熟和衰老進(jìn)程調(diào)控等多種生理生化過(guò)程，還參與植物的多種生物和非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)[3-5]。植物體內(nèi)多胺的生物合成反應(yīng)主要由精氨酸脫羧酶(ADC)、鳥氨酸脫羧酶(ODC)、S-腺苷蛋氨酸脫羧酶(SAMDC)、亞精胺合成酶和精胺合成酶分別催化完成[6]，腐胺位于多胺生物合成途徑的中心位置，腐胺的生物合成代謝由ODC介導(dǎo)的直接途徑和ADC催化的間接途徑完成[7]。
植物ADC基因最早從燕麥植物中獲得克隆[8]，在番茄、擬南芥和煙草等模式植物中ADC基因拷貝數(shù)和基因序列存在一定的差異性。ADC基因在擬南芥中有2個(gè)基因拷貝，基因AtADC2在擬南芥滲透脅迫應(yīng)激反應(yīng)中起主導(dǎo)作用[9]；番茄ADC基因拷貝數(shù)與擬南芥一致，SlADC1和SlADC2基因序列均不含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，高溫和H2O2處理能誘導(dǎo)基因SlADC1和SlADC2轉(zhuǎn)錄表達(dá)，傷害和低溫處理僅能誘導(dǎo)基因SlADC2轉(zhuǎn)錄表達(dá)[10]。煙草NtADC基因編碼721個(gè)氨基酸，ADC蛋白存在于煙草花、種子、莖、葉和根等組織器官，定位于細(xì)胞核和葉綠體2個(gè)不同的亞細(xì)胞區(qū)[11]。蘋果MdADC、葡萄VvADC、桃PpADC、枳PtADC和芒果MiADC等多種果樹植物ADC基因與煙草NtADC具有相似的基因序列，并且果樹ADC基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中受到不同模式的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控[12-14]。
隨著ADC基因從越來(lái)越多植物中獲得克隆，其在植物體內(nèi)的生物功能也得到深入的發(fā)掘和驗(yàn)證。ADC基因參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程[15-16]，枳PtADC基因超表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥、番茄和煙草等模式植物，轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出腐胺含量增加，活性氧(ROS)清除能力增強(qiáng)，從而使轉(zhuǎn)基因植株在干旱逆境脅迫條件下表現(xiàn)出較高的抵抗力[13,17]。在擬南芥中，ADC基因的超量表達(dá)系和突變體均能改變植株的抗逆性。超量表達(dá)擬南芥AtADC2基因可提高轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)腐胺的積累，增強(qiáng)植株對(duì)干旱、鹽堿脅迫的抗逆性[18-19]；缺失突變擬南芥AtADC1、AtADC2基因，突變體植株的游離腐胺含量明顯降低，表現(xiàn)出更強(qiáng)的鹽脅迫或低溫敏感性，外施腐胺能緩解突變體植株凍害的逆境壓力[20-21]。同時(shí)，對(duì)擬南芥ADC基因突變體研究還發(fā)現(xiàn)，AtADC1和AtADC2在擬南芥響應(yīng)低溫脅迫過(guò)程中存在功能冗余性，但AtADC1對(duì)病原菌有特異性誘導(dǎo)，AtADC2對(duì)擬南芥應(yīng)答病原菌過(guò)程中的ADC總活性起著主要作用[22-23]。通過(guò)T-DNA插入突變，獲得擬南芥2個(gè)ADC基因的雙突變體，通過(guò)突變體雜交無(wú)法獲得雙突變體基因型的活子代，表明AtADC基因在擬南芥正常種子發(fā)育過(guò)程中是不可或缺的[24]。目前，ADC基因的功能鑒定與分析主要集中于植物逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程，其在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的研究相對(duì)較少。鑒于此，基于克隆到的桃PpADC基因，通過(guò)構(gòu)建超量表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄，分析PpADC基因在桃樹生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能，從而為發(fā)掘和評(píng)價(jià)桃樹優(yōu)良抗性種質(zhì)提供基因資源，拓展ADC基因在果樹生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中的功能。
1 材料和方法
1.1 材料
番茄Micro-Tom購(gòu)自南京豐碩園藝有限公司。番茄植株生長(zhǎng)于25 ℃光照培養(yǎng)箱，光周期8 h/16 h，播種后21、35、49 d的轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄用于植株生長(zhǎng)發(fā)育觀測(cè)，取播種后35 d的番茄葉片進(jìn)行多胺含量測(cè)定和相關(guān)基因表達(dá)量分析。赤霉素處理：配制含有表面活性劑吐溫20的赤霉素溶液(100 μmol/L)，選取苗齡41 d的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，噴施番茄葉背面1次，通過(guò)測(cè)量植株的株高(頂端組織與第1片真葉之間的長(zhǎng)度)，分析外源赤霉素對(duì)轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響。
大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101均為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院采后生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶SmaⅠ、XbaⅠ、PstⅠ、RNA提取試劑盒和Taq酶等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司武漢分公司完成。
1.2 方法
1.2.1PpADC基因超量表達(dá)載體構(gòu)建 基于PpADC基因編碼序列和pBI121載體的多克隆位點(diǎn)，在基因編碼序列兩端設(shè)計(jì)添加酶切位點(diǎn)的引物(PpADC-XbaⅠ-F，PpADC-SmaⅠ-R)，以限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SmaⅠ酶切PCR產(chǎn)物和pBI121載體，分別回收、純化雙酶切產(chǎn)物，16 ℃連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α構(gòu)建PpADC-pBI121中間載體。以限制性內(nèi)切酶PstⅠ和SmaⅠ酶切中間載體和pCAMBIA1391Z載體，酶切產(chǎn)物分別回收、純化、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，從而構(gòu)建PpADC基因超量表達(dá)載體。重組載體構(gòu)建成功后將其轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3103，并存于-76 ℃超低溫冰箱備用。
1.2.2 轉(zhuǎn)基因材料獲得與鑒定 將構(gòu)建的PpADC超量表達(dá)載體應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化番茄Micro-Tom[17]，設(shè)計(jì)重組載體和外源基因組合引物(35S-F，PpADC-R)，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因材料，收獲陽(yáng)性植株的種子為T0代，播種后再次經(jīng)過(guò)PCR鑒定得到T1代陽(yáng)性植株，用于后續(xù)PpADC基因表達(dá)量測(cè)定和抗性分析。
1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株中相關(guān)基因的表達(dá)量測(cè)定 番茄RNA提取參照Trizol試劑盒說(shuō)明書(TaKaRa，大連)，cDNA合成參照cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(Invitrogen，上海)進(jìn)行，以番茄β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參，引物為β-Actin-F、β-Actin-R(表1)，采用半定量PCR方法分析轉(zhuǎn)基因植株中PpADC、SlGA2ox1(NM_001247936)、SlGA3ox1(AB010991)、SlGA20ox1(AF049898)、SlGA20ox2(AF049899)基因的表達(dá)量[25]。PpADC基因檢測(cè)引物為PpADC-PF、PpADC-PR，SlGA2ox1基因檢測(cè)引物為SlGA2ox1-F、SlGA2ox1-R，SlGA3ox1基因檢測(cè)引物為SlGA3ox1-F、SlGA3ox1-R，SlGA20ox1基因檢測(cè)引物為SlGA20ox1-F、SlGA20ox1-R，SlGA20ox2基因檢測(cè)引物為SlGA20ox2-F、SlGA20ox2-R。PCR反應(yīng)程序：94 ℃，預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃(PpADC、SlGA3ox1、SlGA20ox1、SlGA20ox2)、60 ℃(SlGA2ox1)退火30 s，72 ℃延伸30 s，29(PpADC)、33(SlGA2ox1)、32(SlGA3ox1、SlGA20ox1、SlGA20ox2)個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
表1 轉(zhuǎn)基因材料PCR檢測(cè)及半定量PCR引物
1.2.4 多胺含量測(cè)定 多胺的提取和測(cè)定方法、步驟參照前人研究[26]。安捷倫高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC，Agilent 1200)用于多胺含量的測(cè)定，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，流動(dòng)相為50%甲醇和50%水混合溶液，流速為1 mL/min，進(jìn)行梯度洗脫，色譜柱為安捷倫C18反向色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為25 ℃。
1.3 數(shù)據(jù)處理
試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，采用Microsoft Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及繪圖，采用SPSS Statistics軟件中LSDtest進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 PpADC轉(zhuǎn)基因番茄的獲得和鑒定
潮霉素抗性篩選和PCR檢測(cè)用于鑒定PpADC轉(zhuǎn)基因番茄。應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Micro-Tom番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了68棵具有潮霉素抗性的植株，經(jīng)PCR鑒定獲得38棵轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，采收種子后，取9個(gè)T0代進(jìn)行播種，并進(jìn)行PCR鑒定，PpADC基因在轉(zhuǎn)基因株系#21、#58的T1代植株中基本符合3∶1分離規(guī)律，表明該基因在轉(zhuǎn)基因株系#21、#58中為單基因插入，這2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系適用于后續(xù)PpADC基因超表達(dá)檢測(cè)(圖1)。
M:DL 2000;+:pADC超量表達(dá)載體質(zhì)粒;-:野生型番茄;1—10:轉(zhuǎn)基因株系#21;11—20:轉(zhuǎn)基因株系#58
2.2 PpADC基因在轉(zhuǎn)基因番茄中的表達(dá)量分析
半定量PCR用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株體內(nèi)PpADC基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，PpADC基因在野生型番茄中沒(méi)有表達(dá)，而在轉(zhuǎn)基因株系#21和#58中檢測(cè)到PpADC基因的超量表達(dá)(圖2)。
圖2 PpADC基因在野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因株系(#21、#58)中的表達(dá)量
2.3 轉(zhuǎn)基因番茄中多胺含量分析
對(duì)于腐胺而言，野生型番茄含量為64.17 nmol/g，而轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株含量分別為80.56、83.53 nmol/g，并顯著高于野生型番茄25.54%、30.17%(P<0.05)；亞精胺在野生型番茄中含量為72.89 nmol/g，在轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株中含量分別為79.84、84.30 nmol/g，高于野生型番茄9.53%、15.65%，但差異不顯著(P>0.05)；與腐胺相似，野生型番茄中精胺含量為15.36 nmol/g，而轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株中精胺含量顯著增加(P<0.05)，分別達(dá)到24.64、23.26 nmol/g，高于野生型番茄60.42%、51.43%(圖3)。上述結(jié)果表明，外源基因促進(jìn)了番茄植株中腐胺、亞精胺和精胺等含量上升。
同一物質(zhì)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)
2.4 轉(zhuǎn)基因番茄植株發(fā)育遲緩分析
轉(zhuǎn)基因株系T0代植株存在個(gè)體發(fā)育遲緩的現(xiàn)象，為了分析PpADC基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能，對(duì)野生型番茄和轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株的株高進(jìn)行了評(píng)估。播種后21 d時(shí)，野生型番茄和轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株株高的個(gè)體差異不明顯。播種后35 d時(shí)，野生型番茄的株高明顯高于轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株，這種差異主要體現(xiàn)在新生莖段的莖間長(zhǎng)度。播種后49 d，野生型番茄的株高仍然明顯高于轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株，并且野生型番茄呈現(xiàn)開花盛期，而轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株處于花蕾期或初花期(圖4)。
A：播種后21 d；B：播種后35 d；C：播種后49 d
2.5 轉(zhuǎn)基因番茄赤霉素代謝相關(guān)基因表達(dá)量分析
赤霉素代謝影響著植株正常的生長(zhǎng)發(fā)育，為了解析超量表達(dá)PpADC基因是否會(huì)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控番茄體內(nèi)赤霉素生物合成，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)赤霉素代謝相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了半定量PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，GA20ox1和GA3ox1基因在轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株中表達(dá)量明顯低于野生型番茄；但GA2ox1基因表達(dá)量在野生型番茄和轉(zhuǎn)基因株系中沒(méi)有明顯差異；相對(duì)野生型番茄，GA20ox2基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因株系#21植株中明顯較低，在轉(zhuǎn)基因株系#58植株中差異不明顯(圖5)。
圖5 赤霉素合成相關(guān)基因在野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因株系(#21和#58)中表達(dá)量分析
2.6 外源赤霉素對(duì)轉(zhuǎn)基因株系生長(zhǎng)發(fā)育的恢復(fù)作用
播種后20 d時(shí)，野生型番茄平均株高0.64 cm，轉(zhuǎn)基因株系#21平均株高為0.62 cm，低于野生型番茄3.13%，轉(zhuǎn)基因株系#58平均株高為0.66 cm，高于野生型番茄3.13%，差異都不顯著(P>0.05)(圖6A1、B1)；播種后41 d時(shí)，野生型番茄生長(zhǎng)正常，平均株高4.21 cm，而轉(zhuǎn)基因株系#21、#58生長(zhǎng)顯著矮化(P<0.05)，平均株高分別為2.06、2.15 cm，低于野生型番茄51.07%、48.93%(圖6A2、B2)；以赤霉素溶液噴施苗齡41 d的轉(zhuǎn)基因番茄，噴施后10 d后，野生型番茄平均株高4.33 cm，轉(zhuǎn)基因株系#21、#58植株的平均株高分別為3.96、4.05 cm，分別低于野生型番茄8.55%、6.47%，差異不顯著(P>0.05)，外源噴施赤霉素能恢復(fù)轉(zhuǎn)基因植株株高，但開花進(jìn)程仍然明顯落后于野生型番茄(圖6A3、B3)。
A1、B1:播種后20 d;A2、B2:播種后41 d;A3、B3:播種后51 d
3 結(jié)論與討論
轉(zhuǎn)基因技術(shù)為研究多胺在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中的生物學(xué)功能提供了有效的途徑，植物超量表達(dá)外源ADC基因可以導(dǎo)致體內(nèi)腐胺的積累，ADC基因功能缺失突變體植株體內(nèi)多胺含量明顯降低[15,27]。本研究中，PpADC基因遺傳轉(zhuǎn)化番茄Micro-Tom后，在轉(zhuǎn)基因番茄中正常超量表達(dá)，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的腐胺、亞精胺和精胺含量均明顯高于野生型番茄。轉(zhuǎn)基因水稻中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，腐胺和精胺在超量表達(dá)燕麥ADC基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株體內(nèi)積累[28]。因此，我們推測(cè)植物體內(nèi)ADC基因高效表達(dá)產(chǎn)生腐胺積累，才能引起亞精胺和精胺含量增加，從而觸發(fā)植物體內(nèi)多胺代謝。然而腐胺的積累不一定導(dǎo)致亞精胺和精胺的增加，在楊樹和擬南芥中超量表達(dá)小鼠ODC基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因植株腐胺含量增加數(shù)倍，但亞精胺和精胺含量沒(méi)有明顯變化[29]。推測(cè)這種差異可能與植物體內(nèi)腐胺合成由ADC和ODC 2條途徑相關(guān)。
植物內(nèi)源多胺含量影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育，突變體和轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)多胺含量變化造成了植株表型的改變，然而，多胺在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的確切作用還不清楚[30]。相對(duì)于野生型植株，超量表達(dá)PpADC的轉(zhuǎn)基因植株展現(xiàn)出生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和晚花的表型，主要表現(xiàn)在莖節(jié)長(zhǎng)度明顯縮短。類似的表型也出現(xiàn)在其他轉(zhuǎn)基因植物中，超量表達(dá)燕麥ADC基因的轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)腐胺含量明顯增加，ADC活性明顯高于對(duì)照，轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)出節(jié)間縮短的表型[31]。PtADC超量表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化柑橘，不僅提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱、抗寒能力，而且還使轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出矮化的性狀[32]。擬南芥超量表達(dá)AtADC2基因的轉(zhuǎn)基因植株伴隨ADC2基因表達(dá)量的提高，體內(nèi)腐胺含量明顯增加，植株表現(xiàn)出矮化和晚花性狀[33]。這些研究支撐了ADC基因的高效表達(dá)能提高植物體內(nèi)腐胺合成，從而引起植物生長(zhǎng)矮化的假設(shè)。但這個(gè)假設(shè)并不適用于ODC基因合成腐胺途徑，在產(chǎn)生高水平scFvODC1的轉(zhuǎn)基因煙草中，植物體內(nèi)ODC活性受到抑制，腐胺、亞精胺和精胺含量均明顯減少，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)異常并表現(xiàn)出矮化的性狀[34]。
赤霉素在植物體內(nèi)不僅影響莖的伸長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)植株葉片伸展、成花誘導(dǎo)和花藥發(fā)育起著重要的調(diào)控作用[35]。超量表達(dá)AtADC2基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因植物節(jié)間縮短和開花延遲，外施赤霉素能有效恢復(fù)植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育[33]。與AtADC2轉(zhuǎn)基因擬南芥相似，外源噴施能恢復(fù)超量表達(dá)PpADC基因番茄的株高，但轉(zhuǎn)基因番茄的花期仍然延遲于野生型番茄，這可能與外源赤霉素的噴施時(shí)期相關(guān)。GA20ox、GA2ox和GA3ox是植物體內(nèi)赤霉素生物合成途徑中的3個(gè)加雙氧酶，它們負(fù)責(zé)催化GA12最終生成其他種類的赤霉素[36]。本研究中PpADC基因超量表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因番茄體內(nèi)腐胺積累增加，基因GA3ox1、GA20ox1和GA20ox2下調(diào)表達(dá)，這表明腐胺可能作為內(nèi)源信號(hào)調(diào)控赤霉素合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)，從而使植物正常的赤霉素合成代謝受到抑制，赤霉素含量的降低導(dǎo)致植株生長(zhǎng)緩慢，并影響了植株的正常開花進(jìn)程。這個(gè)推測(cè)在擬南芥研究中得到驗(yàn)證，正常條件下，過(guò)量表達(dá)AtADC2基因的植株體內(nèi)赤霉素減少，導(dǎo)致植株矮化和開花推遲[37]。
多胺參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的多種生理生化反應(yīng)，植物體內(nèi)的多胺合成和降解受到精確機(jī)制的調(diào)控，過(guò)多或過(guò)少的多胺含量都會(huì)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)異常[38]。PpADC轉(zhuǎn)基因番茄植株內(nèi)源多胺含量及其表型的變化有力地支撐了多胺參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的理論。植物體內(nèi)多胺和赤霉素代謝網(wǎng)絡(luò)途徑存在交叉，但赤霉素在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的多重作用決定了其調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性[39-40]。因此，PpADC基因?qū)χ仓陜?nèi)源赤霉素合成的調(diào)控作用及其途徑有待進(jìn)一步研究。
猜你喜歡
誰(shuí)是最好的植物？少兒科學(xué)周刊·兒童版(2021年19期)2021-12-10 14:13:40 為什么植物也要睡覺(jué)小學(xué)閱讀指南·低年級(jí)版(2021年3期)2021-03-19 06:12:40 長(zhǎng)得最快的植物小天使·二年級(jí)語(yǔ)數(shù)英綜合(2020年8期)2020-12-23 04:57:40 各種有趣的植物小天使·一年級(jí)語(yǔ)數(shù)英綜合(2020年11期)2020-12-16 02:57:22 植物也會(huì)感到痛苦學(xué)苑創(chuàng)造·A版(2020年3期)2020-04-24 09:21:39 會(huì)喝水的植物小溪流(畫刊)(2017年11期)2018-01-09 19:15:14 植物的防身術(shù)少兒科學(xué)周刊·兒童版(2017年5期)2017-06-29 22:24:28 把植物做成藥少兒科學(xué)周刊·兒童版(2017年5期)2017-06-29 16:46:33 哦，不怕，不怕紅領(lǐng)巾·萌芽(2017年5期)2017-06-23 10:35:59 將植物穿身上爆笑ｓｈｏｗ(2016年7期)2017-02-09 09:36:13
王保全，張曉娜，李國(guó)懷
(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)
多胺(PAs)是一類具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿，廣泛存在于原核和真核生物體中。植物體內(nèi)具有重要生物功能的多胺主要有腐胺(Put)、精胺(Spm)和亞精胺(Spd)等[1-2]。多胺參與植物種子形成、器官發(fā)育、果實(shí)成熟和衰老進(jìn)程調(diào)控等多種生理生化過(guò)程，還參與植物的多種生物和非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)[3-5]。植物體內(nèi)多胺的生物合成反應(yīng)主要由精氨酸脫羧酶(ADC)、鳥氨酸脫羧酶(ODC)、S-腺苷蛋氨酸脫羧酶(SAMDC)、亞精胺合成酶和精胺合成酶分別催化完成[6]，腐胺位于多胺生物合成途徑的中心位置，腐胺的生物合成代謝由ODC介導(dǎo)的直接途徑和ADC催化的間接途徑完成[7]。
植物ADC基因最早從燕麥植物中獲得克隆[8]，在番茄、擬南芥和煙草等模式植物中ADC基因拷貝數(shù)和基因序列存在一定的差異性。ADC基因在擬南芥中有2個(gè)基因拷貝，基因AtADC2在擬南芥滲透脅迫應(yīng)激反應(yīng)中起主導(dǎo)作用[9]；番茄ADC基因拷貝數(shù)與擬南芥一致，SlADC1和SlADC2基因序列均不含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，高溫和H2O2處理能誘導(dǎo)基因SlADC1和SlADC2轉(zhuǎn)錄表達(dá)，傷害和低溫處理僅能誘導(dǎo)基因SlADC2轉(zhuǎn)錄表達(dá)[10]。煙草NtADC基因編碼721個(gè)氨基酸，ADC蛋白存在于煙草花、種子、莖、葉和根等組織器官，定位于細(xì)胞核和葉綠體2個(gè)不同的亞細(xì)胞區(qū)[11]。蘋果MdADC、葡萄VvADC、桃PpADC、枳PtADC和芒果MiADC等多種果樹植物ADC基因與煙草NtADC具有相似的基因序列，并且果樹ADC基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中受到不同模式的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控[12-14]。
隨著ADC基因從越來(lái)越多植物中獲得克隆，其在植物體內(nèi)的生物功能也得到深入的發(fā)掘和驗(yàn)證。ADC基因參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程[15-16]，枳PtADC基因超表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥、番茄和煙草等模式植物，轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出腐胺含量增加，活性氧(ROS)清除能力增強(qiáng)，從而使轉(zhuǎn)基因植株在干旱逆境脅迫條件下表現(xiàn)出較高的抵抗力[13,17]。在擬南芥中，ADC基因的超量表達(dá)系和突變體均能改變植株的抗逆性。超量表達(dá)擬南芥AtADC2基因可提高轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)腐胺的積累，增強(qiáng)植株對(duì)干旱、鹽堿脅迫的抗逆性[18-19]；缺失突變擬南芥AtADC1、AtADC2基因，突變體植株的游離腐胺含量明顯降低，表現(xiàn)出更強(qiáng)的鹽脅迫或低溫敏感性，外施腐胺能緩解突變體植株凍害的逆境壓力[20-21]。同時(shí)，對(duì)擬南芥ADC基因突變體研究還發(fā)現(xiàn)，AtADC1和AtADC2在擬南芥響應(yīng)低溫脅迫過(guò)程中存在功能冗余性，但AtADC1對(duì)病原菌有特異性誘導(dǎo)，AtADC2對(duì)擬南芥應(yīng)答病原菌過(guò)程中的ADC總活性起著主要作用[22-23]。通過(guò)T-DNA插入突變，獲得擬南芥2個(gè)ADC基因的雙突變體，通過(guò)突變體雜交無(wú)法獲得雙突變體基因型的活子代，表明AtADC基因在擬南芥正常種子發(fā)育過(guò)程中是不可或缺的[24]。目前，ADC基因的功能鑒定與分析主要集中于植物逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程，其在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的研究相對(duì)較少。鑒于此，基于克隆到的桃PpADC基因，通過(guò)構(gòu)建超量表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄，分析PpADC基因在桃樹生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能，從而為發(fā)掘和評(píng)價(jià)桃樹優(yōu)良抗性種質(zhì)提供基因資源，拓展ADC基因在果樹生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中的功能。
1 材料和方法
1.1 材料
番茄Micro-Tom購(gòu)自南京豐碩園藝有限公司。番茄植株生長(zhǎng)于25 ℃光照培養(yǎng)箱，光周期8 h/16 h，播種后21、35、49 d的轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄用于植株生長(zhǎng)發(fā)育觀測(cè)，取播種后35 d的番茄葉片進(jìn)行多胺含量測(cè)定和相關(guān)基因表達(dá)量分析。赤霉素處理：配制含有表面活性劑吐溫20的赤霉素溶液(100 μmol/L)，選取苗齡41 d的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，噴施番茄葉背面1次，通過(guò)測(cè)量植株的株高(頂端組織與第1片真葉之間的長(zhǎng)度)，分析外源赤霉素對(duì)轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響。
大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101均為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院采后生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶SmaⅠ、XbaⅠ、PstⅠ、RNA提取試劑盒和Taq酶等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司武漢分公司完成。
1.2 方法
1.2.1PpADC基因超量表達(dá)載體構(gòu)建 基于PpADC基因編碼序列和pBI121載體的多克隆位點(diǎn)，在基因編碼序列兩端設(shè)計(jì)添加酶切位點(diǎn)的引物(PpADC-XbaⅠ-F，PpADC-SmaⅠ-R)，以限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SmaⅠ酶切PCR產(chǎn)物和pBI121載體，分別回收、純化雙酶切產(chǎn)物，16 ℃連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α構(gòu)建PpADC-pBI121中間載體。以限制性內(nèi)切酶PstⅠ和SmaⅠ酶切中間載體和pCAMBIA1391Z載體，酶切產(chǎn)物分別回收、純化、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，從而構(gòu)建PpADC基因超量表達(dá)載體。重組載體構(gòu)建成功后將其轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3103，并存于-76 ℃超低溫冰箱備用。
1.2.2 轉(zhuǎn)基因材料獲得與鑒定 將構(gòu)建的PpADC超量表達(dá)載體應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化番茄Micro-Tom[17]，設(shè)計(jì)重組載體和外源基因組合引物(35S-F，PpADC-R)，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因材料，收獲陽(yáng)性植株的種子為T0代，播種后再次經(jīng)過(guò)PCR鑒定得到T1代陽(yáng)性植株，用于后續(xù)PpADC基因表達(dá)量測(cè)定和抗性分析。
1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株中相關(guān)基因的表達(dá)量測(cè)定 番茄RNA提取參照Trizol試劑盒說(shuō)明書(TaKaRa，大連)，cDNA合成參照cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(Invitrogen，上海)進(jìn)行，以番茄β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參，引物為β-Actin-F、β-Actin-R(表1)，采用半定量PCR方法分析轉(zhuǎn)基因植株中PpADC、SlGA2ox1(NM_001247936)、SlGA3ox1(AB010991)、SlGA20ox1(AF049898)、SlGA20ox2(AF049899)基因的表達(dá)量[25]。PpADC基因檢測(cè)引物為PpADC-PF、PpADC-PR，SlGA2ox1基因檢測(cè)引物為SlGA2ox1-F、SlGA2ox1-R，SlGA3ox1基因檢測(cè)引物為SlGA3ox1-F、SlGA3ox1-R，SlGA20ox1基因檢測(cè)引物為SlGA20ox1-F、SlGA20ox1-R，SlGA20ox2基因檢測(cè)引物為SlGA20ox2-F、SlGA20ox2-R。PCR反應(yīng)程序：94 ℃，預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃(PpADC、SlGA3ox1、SlGA20ox1、SlGA20ox2)、60 ℃(SlGA2ox1)退火30 s，72 ℃延伸30 s，29(PpADC)、33(SlGA2ox1)、32(SlGA3ox1、SlGA20ox1、SlGA20ox2)個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
表1 轉(zhuǎn)基因材料PCR檢測(cè)及半定量PCR引物
1.2.4 多胺含量測(cè)定 多胺的提取和測(cè)定方法、步驟參照前人研究[26]。安捷倫高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC，Agilent 1200)用于多胺含量的測(cè)定，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，流動(dòng)相為50%甲醇和50%水混合溶液，流速為1 mL/min，進(jìn)行梯度洗脫，色譜柱為安捷倫C18反向色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為25 ℃。
1.3 數(shù)據(jù)處理
試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，采用Microsoft Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及繪圖，采用SPSS Statistics軟件中LSDtest進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 PpADC轉(zhuǎn)基因番茄的獲得和鑒定
潮霉素抗性篩選和PCR檢測(cè)用于鑒定PpADC轉(zhuǎn)基因番茄。應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Micro-Tom番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了68棵具有潮霉素抗性的植株，經(jīng)PCR鑒定獲得38棵轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，采收種子后，取9個(gè)T0代進(jìn)行播種，并進(jìn)行PCR鑒定，PpADC基因在轉(zhuǎn)基因株系#21、#58的T1代植株中基本符合3∶1分離規(guī)律，表明該基因在轉(zhuǎn)基因株系#21、#58中為單基因插入，這2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系適用于后續(xù)PpADC基因超表達(dá)檢測(cè)(圖1)。
M:DL 2000;+:pADC超量表達(dá)載體質(zhì)粒;-:野生型番茄;1—10:轉(zhuǎn)基因株系#21;11—20:轉(zhuǎn)基因株系#58
2.2 PpADC基因在轉(zhuǎn)基因番茄中的表達(dá)量分析
半定量PCR用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株體內(nèi)PpADC基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，PpADC基因在野生型番茄中沒(méi)有表達(dá)，而在轉(zhuǎn)基因株系#21和#58中檢測(cè)到PpADC基因的超量表達(dá)(圖2)。
圖2 PpADC基因在野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因株系(#21、#58)中的表達(dá)量
2.3 轉(zhuǎn)基因番茄中多胺含量分析
對(duì)于腐胺而言，野生型番茄含量為64.17 nmol/g，而轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株含量分別為80.56、83.53 nmol/g，并顯著高于野生型番茄25.54%、30.17%(P<0.05)；亞精胺在野生型番茄中含量為72.89 nmol/g，在轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株中含量分別為79.84、84.30 nmol/g，高于野生型番茄9.53%、15.65%，但差異不顯著(P>0.05)；與腐胺相似，野生型番茄中精胺含量為15.36 nmol/g，而轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株中精胺含量顯著增加(P<0.05)，分別達(dá)到24.64、23.26 nmol/g，高于野生型番茄60.42%、51.43%(圖3)。上述結(jié)果表明，外源基因促進(jìn)了番茄植株中腐胺、亞精胺和精胺等含量上升。
同一物質(zhì)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)
2.4 轉(zhuǎn)基因番茄植株發(fā)育遲緩分析
轉(zhuǎn)基因株系T0代植株存在個(gè)體發(fā)育遲緩的現(xiàn)象，為了分析PpADC基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能，對(duì)野生型番茄和轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株的株高進(jìn)行了評(píng)估。播種后21 d時(shí)，野生型番茄和轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株株高的個(gè)體差異不明顯。播種后35 d時(shí)，野生型番茄的株高明顯高于轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株，這種差異主要體現(xiàn)在新生莖段的莖間長(zhǎng)度。播種后49 d，野生型番茄的株高仍然明顯高于轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株，并且野生型番茄呈現(xiàn)開花盛期，而轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株處于花蕾期或初花期(圖4)。
A：播種后21 d；B：播種后35 d；C：播種后49 d
2.5 轉(zhuǎn)基因番茄赤霉素代謝相關(guān)基因表達(dá)量分析
赤霉素代謝影響著植株正常的生長(zhǎng)發(fā)育，為了解析超量表達(dá)PpADC基因是否會(huì)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控番茄體內(nèi)赤霉素生物合成，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)赤霉素代謝相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了半定量PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，GA20ox1和GA3ox1基因在轉(zhuǎn)基因株系#21和#58植株中表達(dá)量明顯低于野生型番茄；但GA2ox1基因表達(dá)量在野生型番茄和轉(zhuǎn)基因株系中沒(méi)有明顯差異；相對(duì)野生型番茄，GA20ox2基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因株系#21植株中明顯較低，在轉(zhuǎn)基因株系#58植株中差異不明顯(圖5)。
圖5 赤霉素合成相關(guān)基因在野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因株系(#21和#58)中表達(dá)量分析
2.6 外源赤霉素對(duì)轉(zhuǎn)基因株系生長(zhǎng)發(fā)育的恢復(fù)作用
播種后20 d時(shí)，野生型番茄平均株高0.64 cm，轉(zhuǎn)基因株系#21平均株高為0.62 cm，低于野生型番茄3.13%，轉(zhuǎn)基因株系#58平均株高為0.66 cm，高于野生型番茄3.13%，差異都不顯著(P>0.05)(圖6A1、B1)；播種后41 d時(shí)，野生型番茄生長(zhǎng)正常，平均株高4.21 cm，而轉(zhuǎn)基因株系#21、#58生長(zhǎng)顯著矮化(P<0.05)，平均株高分別為2.06、2.15 cm，低于野生型番茄51.07%、48.93%(圖6A2、B2)；以赤霉素溶液噴施苗齡41 d的轉(zhuǎn)基因番茄，噴施后10 d后，野生型番茄平均株高4.33 cm，轉(zhuǎn)基因株系#21、#58植株的平均株高分別為3.96、4.05 cm，分別低于野生型番茄8.55%、6.47%，差異不顯著(P>0.05)，外源噴施赤霉素能恢復(fù)轉(zhuǎn)基因植株株高，但開花進(jìn)程仍然明顯落后于野生型番茄(圖6A3、B3)。
A1、B1:播種后20 d;A2、B2:播種后41 d;A3、B3:播種后51 d
3 結(jié)論與討論
轉(zhuǎn)基因技術(shù)為研究多胺在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中的生物學(xué)功能提供了有效的途徑，植物超量表達(dá)外源ADC基因可以導(dǎo)致體內(nèi)腐胺的積累，ADC基因功能缺失突變體植株體內(nèi)多胺含量明顯降低[15,27]。本研究中，PpADC基因遺傳轉(zhuǎn)化番茄Micro-Tom后，在轉(zhuǎn)基因番茄中正常超量表達(dá)，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的腐胺、亞精胺和精胺含量均明顯高于野生型番茄。轉(zhuǎn)基因水稻中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，腐胺和精胺在超量表達(dá)燕麥ADC基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株體內(nèi)積累[28]。因此，我們推測(cè)植物體內(nèi)ADC基因高效表達(dá)產(chǎn)生腐胺積累，才能引起亞精胺和精胺含量增加，從而觸發(fā)植物體內(nèi)多胺代謝。然而腐胺的積累不一定導(dǎo)致亞精胺和精胺的增加，在楊樹和擬南芥中超量表達(dá)小鼠ODC基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因植株腐胺含量增加數(shù)倍，但亞精胺和精胺含量沒(méi)有明顯變化[29]。推測(cè)這種差異可能與植物體內(nèi)腐胺合成由ADC和ODC 2條途徑相關(guān)。
植物內(nèi)源多胺含量影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育，突變體和轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)多胺含量變化造成了植株表型的改變，然而，多胺在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的確切作用還不清楚[30]。相對(duì)于野生型植株，超量表達(dá)PpADC的轉(zhuǎn)基因植株展現(xiàn)出生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和晚花的表型，主要表現(xiàn)在莖節(jié)長(zhǎng)度明顯縮短。類似的表型也出現(xiàn)在其他轉(zhuǎn)基因植物中，超量表達(dá)燕麥ADC基因的轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)腐胺含量明顯增加，ADC活性明顯高于對(duì)照，轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)出節(jié)間縮短的表型[31]。PtADC超量表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化柑橘，不僅提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱、抗寒能力，而且還使轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出矮化的性狀[32]。擬南芥超量表達(dá)AtADC2基因的轉(zhuǎn)基因植株伴隨ADC2基因表達(dá)量的提高，體內(nèi)腐胺含量明顯增加，植株表現(xiàn)出矮化和晚花性狀[33]。這些研究支撐了ADC基因的高效表達(dá)能提高植物體內(nèi)腐胺合成，從而引起植物生長(zhǎng)矮化的假設(shè)。但這個(gè)假設(shè)并不適用于ODC基因合成腐胺途徑，在產(chǎn)生高水平scFvODC1的轉(zhuǎn)基因煙草中，植物體內(nèi)ODC活性受到抑制，腐胺、亞精胺和精胺含量均明顯減少，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)異常并表現(xiàn)出矮化的性狀[34]。
赤霉素在植物體內(nèi)不僅影響莖的伸長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)植株葉片伸展、成花誘導(dǎo)和花藥發(fā)育起著重要的調(diào)控作用[35]。超量表達(dá)AtADC2基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因植物節(jié)間縮短和開花延遲，外施赤霉素能有效恢復(fù)植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育[33]。與AtADC2轉(zhuǎn)基因擬南芥相似，外源噴施能恢復(fù)超量表達(dá)PpADC基因番茄的株高，但轉(zhuǎn)基因番茄的花期仍然延遲于野生型番茄，這可能與外源赤霉素的噴施時(shí)期相關(guān)。GA20ox、GA2ox和GA3ox是植物體內(nèi)赤霉素生物合成途徑中的3個(gè)加雙氧酶，它們負(fù)責(zé)催化GA12最終生成其他種類的赤霉素[36]。本研究中PpADC基因超量表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因番茄體內(nèi)腐胺積累增加，基因GA3ox1、GA20ox1和GA20ox2下調(diào)表達(dá)，這表明腐胺可能作為內(nèi)源信號(hào)調(diào)控赤霉素合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)，從而使植物正常的赤霉素合成代謝受到抑制，赤霉素含量的降低導(dǎo)致植株生長(zhǎng)緩慢，并影響了植株的正常開花進(jìn)程。這個(gè)推測(cè)在擬南芥研究中得到驗(yàn)證，正常條件下，過(guò)量表達(dá)AtADC2基因的植株體內(nèi)赤霉素減少，導(dǎo)致植株矮化和開花推遲[37]。
多胺參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的多種生理生化反應(yīng)，植物體內(nèi)的多胺合成和降解受到精確機(jī)制的調(diào)控，過(guò)多或過(guò)少的多胺含量都會(huì)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)異常[38]。PpADC轉(zhuǎn)基因番茄植株內(nèi)源多胺含量及其表型的變化有力地支撐了多胺參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的理論。植物體內(nèi)多胺和赤霉素代謝網(wǎng)絡(luò)途徑存在交叉，但赤霉素在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的多重作用決定了其調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性[39-40]。因此，PpADC基因?qū)χ仓陜?nèi)源赤霉素合成的調(diào)控作用及其途徑有待進(jìn)一步研究。
猜你喜歡
少兒科學(xué)周刊·兒童版(2021年19期)2021-12-10 14:13:40
小學(xué)閱讀指南·低年級(jí)版(2021年3期)2021-03-19 06:12:40
小天使·二年級(jí)語(yǔ)數(shù)英綜合(2020年8期)2020-12-23 04:57:40
小天使·一年級(jí)語(yǔ)數(shù)英綜合(2020年11期)2020-12-16 02:57:22
學(xué)苑創(chuàng)造·A版(2020年3期)2020-04-24 09:21:39
小溪流(畫刊)(2017年11期)2018-01-09 19:15:14
少兒科學(xué)周刊·兒童版(2017年5期)2017-06-29 22:24:28
少兒科學(xué)周刊·兒童版(2017年5期)2017-06-29 16:46:33
紅領(lǐng)巾·萌芽(2017年5期)2017-06-23 10:35:59
爆笑ｓｈｏｗ(2016年7期)2017-02-09 09:36:13
