曾潔，鄧志慧，付紅娟，劉暢，古儀，鄒奕昕，?；?/p>

茶黃素激活Nrf2/HO-1通路保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷

曾潔，鄧志慧，付紅娟，劉暢，古儀，鄒奕昕，?；?

西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715

為探討茶黃素（Theaflavin，TF）對過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)效應(yīng)及作用機(jī)制，將人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC分為對照組、損傷組（0.2?mmol·L-1H2O2處理）和TF預(yù)處理組（2.0、5.0、10.0?μmol·L-1TF和0.2?mmol·L-1H2O2處理）。損傷組和TF組均以H2O2處理24?h，其中TF組先以不同濃度TF預(yù)處理2?h，對照組均以定量溶劑處理。以MTT法測定細(xì)胞活力，DCFH-DA探針測定活性氧（ROS）水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，Western blot測定蛋白表達(dá)水平，相應(yīng)試劑盒測定乳酸脫氫酶（LDH）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化氫酶（GSH-Px）活性。結(jié)果顯示，與對照組相比，損傷組細(xì)胞活力顯著降低，LDH釋放量增加，NO水平降低，胞內(nèi)ROS水平升高，MDA增加，抗氧化酶活力降低，細(xì)胞凋亡升高；TF預(yù)處理能夠顯著提高細(xì)胞活力，降低LDH水平，維持NO水平，降低胞內(nèi)ROS水平及MDA的產(chǎn)生，提高抗氧化酶活力，并抑制細(xì)胞凋亡；進(jìn)一步研究顯示，TF能夠激活Nrf2/HO-1通路，且Nrf2抑制劑會顯著降低TF的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。可見，TF能夠有效抑制H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制至少部分是通過激活Nrf2/HO-1通路實(shí)現(xiàn)的。

茶黃素；血管內(nèi)皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激損傷；保護(hù)機(jī)制；動(dòng)脈粥樣硬化

隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、人們生活方式的改變，以及人口老齡化和城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加快，心血管病相關(guān)危險(xiǎn)因素的流行趨勢明顯，心血管病發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)均持續(xù)增高，且在未來10年還會繼續(xù)升高。目前，我國心血管病患病人數(shù)約為2.9億，其中腦卒中1?300多萬，冠心病1?100多萬，心血管病死亡率居我國居民疾病總死亡原因的首位，占疾病死亡構(gòu)成的40%以上[1-3]。同時(shí)，心血管病住院總費(fèi)用也在快速增加，增長速度遠(yuǎn)高于我國國民生產(chǎn)總值增速。心血管病的負(fù)擔(dān)日漸加重，已經(jīng)成為我國重大的公共衛(wèi)生問題，有效防治心血管病刻不容緩。

飲食、營養(yǎng)與心血管病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，探討通過膳食途徑預(yù)防血管病變、腦卒中、心臟病等，具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。研究發(fā)現(xiàn)，長期飲用紅茶能夠顯著降低血漿低密度脂蛋白（LDL）和總膽固醇水平，同時(shí)降低收縮壓，還可抑制體重增加，降低腰圍和腰臀比[4-5]。這表明，紅茶對于心血管病可能具有良好的預(yù)防作用。茶黃素（Theaflavin，TF）是紅茶中存在的一類重要的生物活性物質(zhì)，對紅茶的湯色、滋味和品質(zhì)起著決定性的作用，是紅茶具備生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)[6-7]。目前，已從紅茶中分離鑒定出20多種TF類化合物（TFs），這些TF衍生物與TF具有相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性，其中最主要的TFs有4種：TF、茶黃素-3-沒食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素-3'-沒食子酸酯（TF-3'-G）和茶黃素-3,3'-雙沒食子酸酯（TFDG）[8-9]。研究顯示，TFs具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、降脂等作用[10-14]，但其對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)研究尚少，且機(jī)制不清。本研究以H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察TF對內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)，并探討相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），購于上海蓋寧生物科技有限公司。TF（純度98%）購于南京草本源生物科技有限公司，用二甲基亞砜（DMSO）溶解–20℃避光分裝保存?zhèn)溆谩MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶購于美國Gibco公司。DMSO、噻唑藍(lán)（MTT）、乳酸脫氫酶（LDH）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購于北京眾康志恒生物科技有限公司。RIPA細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白含量測定試劑盒、一抗Nrf2、HO-1、-actin、二抗和DAB顯色試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)研究所。EpiQuik核蛋白提取試劑盒購于艾美捷科技有限公司。Nrf2抑制劑ML385購于Selleck Chemicals公司。

1.2 材料與方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

采用10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，常規(guī)換液和傳代。將細(xì)胞分為3組：對照組（NC）、損傷組（MC）和TF預(yù)處理組（P-TF）（2.0、5.0、10.0?μmol·L-1處理組）。P-TF先以2.0、5.0、10.0?μmol·L-1的TF處理細(xì)胞2?h，然后以PBS清洗2次，加入新鮮培養(yǎng)基，再以0.2?mmol·L-1的H2O2處理細(xì)胞24?h；MC以等量溶劑處理2?h，PBS清洗2次，再以H2O2處理細(xì)胞24?h；NC均以等量溶劑做相應(yīng)處理。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活力水平

取對數(shù)生長期的第2~4代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×104個(gè)·mL-1接種于96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，每孔100?μL。細(xì)胞按前述分組處理，處理完成前4?h，每孔加20?μL 5?mg·mL-1MTT，棄上清液，以PBS洗2次，每孔加入150?μL DMSO溶解結(jié)晶顆粒，搖床低速振蕩10?min（或37℃孵育15?min溶解結(jié)晶），在酶標(biāo)儀490?nm處測定吸光度，設(shè)空白調(diào)零。

1.2.3 細(xì)胞上清液LDH和NO水平測定

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于24孔板，按上述分組處理，然后分離細(xì)胞培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格依照試劑盒說明書測定上清液中LDH活性水平和NO含量。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS測定

將細(xì)胞接種于6孔板，分組處理后棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，然后加入10?μmol·L-1DCFH-DA，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15?min；熒光顯微鏡下取相，使用多功能酶標(biāo)儀在488?nm激發(fā)波長、525?nm發(fā)射波長下測定熒光強(qiáng)度。

1.2.5 細(xì)胞MDA水平及SOD、CAT和GSH-Px活性水平的測定

將細(xì)胞接種于6孔板，分組處理后消化、離心、棄上清液，加入500?μL PBS制成細(xì)胞懸浮液，超聲裂解，嚴(yán)格依照相應(yīng)檢測試劑盒說明書測定。

1.2.6 細(xì)胞凋亡的測定

將細(xì)胞接種于6孔板，分組干預(yù)處理后，消化、離心、棄上清液，收集各組細(xì)胞，用500?μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，而后分別加入10?μL Annexin V-FITC和10?μL PI染料，混勻后于室溫避光條件下反應(yīng)15?min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

總凋亡細(xì)胞率=早期凋亡細(xì)胞率＋晚期凋亡細(xì)胞率。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平

收集細(xì)胞，利用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，同時(shí)按照核蛋白提取試劑盒操作說明提取核蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定；根據(jù)蛋白濃度，以12%分離膠、5%濃縮膠SDS-PAGE電泳，上樣量為20?μL（含40?μg蛋白）。用半干性轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉（TBST配制）封閉2?h。一抗Nrf2、HO-1（1︰1?000），4℃孵育過夜，TBST振搖洗膜3次后，各10?min，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（1︰5?000），室溫振蕩孵育1?h，再以TBST振搖洗膜3次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，采用VILBER FUSION FX7成像系統(tǒng)自動(dòng)曝光。利用Quantity One軟件進(jìn)行條帶分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 TF對HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

以不同濃度的茶黃素（TF）處理HUVEC細(xì)胞24?h，觀察茶黃素對細(xì)胞活力的影響。如圖1所示，茶黃素在0~120?μmol·L-1濃度劑量內(nèi)，與NC比較，對HUVEC細(xì)胞增殖活力無顯著影響，未見明顯細(xì)胞毒作用。

2.2 TF預(yù)處理對H2O2作用下HUVEC細(xì)胞活力及凋亡的影響

分別以2.0、5.0?μmol·L-1和10.0?μmol·L-1的TF預(yù)處理HUVEC細(xì)胞2?h，觀察其對H2O2（0.2?mmol·L-1）作用下HUVEC細(xì)胞活力及凋亡的影響。結(jié)果如圖2所示，H2O2處理細(xì)胞24?h，與空白對照組比較，細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高；TF預(yù)處理能夠顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，提高細(xì)胞活力，并抑制細(xì)胞凋亡，其保護(hù)作用呈劑量依賴性效應(yīng)關(guān)系。

2.3 TF預(yù)處理對氧化應(yīng)激條件下內(nèi)皮細(xì)胞LDH和NO釋放水平的影響

分離細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，檢測各組細(xì)胞LDH和NO釋放水平，結(jié)果如圖3所示，H2O2作用下細(xì)胞LDH的釋放水平顯著升高，而NO釋放水平明顯降低，表明內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到損害，導(dǎo)致胞內(nèi)LDH外泄量增加，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，分泌NO的能力降低；TF預(yù)處理能夠有效抑制LDH水平的升高和NO水平的降低，表明TF可有效保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，減輕細(xì)胞損傷，維護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能正常。

2.4 TF預(yù)處理對H2O2作用下內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平和MDA生成的影響

由圖4中ROS水平的檢測結(jié)果顯示，H2O2作用下內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平顯著升高，表明胞內(nèi)氧化應(yīng)激壓力增大；與此一致，細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)物脂質(zhì)過氧化物MDA水平顯著升高；TF預(yù)處理能夠有效降低胞內(nèi)ROS水平，且顯著抑制MDA的生成，這表明TF預(yù)處理可以有效減輕H2O2造成的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

圖1 不同濃度TF處理HUVEC細(xì)胞24?h對細(xì)胞活力的影響

圖2 TF預(yù)處理對H2O2作用下HUVEC細(xì)胞活力及凋亡的影響

圖3 TF預(yù)處理對H2O2作用下內(nèi)皮細(xì)胞LDH和NO釋放水平的影響

圖4 TF預(yù)處理對H2O2作用下內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平和MDA生成的影響

2.5 TF預(yù)處理對氧化應(yīng)激條件下內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化酶活性的影響

由圖5可見，對內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活性水平的檢測結(jié)果顯示，H2O2作用下細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT和GSH-Px活性水平均出現(xiàn)不同程度下降，表明細(xì)胞氧化-還原調(diào)節(jié)系統(tǒng)明顯受損；TF預(yù)處理能夠有效增強(qiáng)SOD、CAT和GSH-Px活性水平，維持細(xì)胞氧化-還原調(diào)節(jié)平衡，提高內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)對氧化應(yīng)激的能力。

2.6 Nrf2/HO-1信號通路在TF抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用

Nrf2信號通路在氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，本研究采用Western blot方法檢測了Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)水平（圖6）。由圖6可見，H2O2作用后受損細(xì)胞Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低，TF能夠上調(diào)Nrf2的表達(dá)及核移位，激活Nrf2/HO-1信號通路。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Nrf2信號通路在TF抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用，以Nrf2的抑制劑ML385干預(yù)試驗(yàn)，觀察其對TF保護(hù)效應(yīng)的影響。可見，ML385會顯著降低核內(nèi)Nrf2的水平和HO-1表達(dá)水平，并減弱TF對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和凋亡的抑制作用，說明TF至少部分是通過激活Nrf2信號通路發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的。

圖5 TF預(yù)處理對H2O2作用下內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化酶活性的影響

圖6 Nrf2信號通路在TF抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用

3 討論

TFs占紅茶固形物的0.3%~1.5%，是紅茶中一類重要的活性成分[15]。TFs是兒茶素類化合物（包括兒茶素、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等）在多酚氧化酶的催化下，通過與空氣中氧氣進(jìn)行氧化縮合而形成，是一類苯駢?酚酮類衍生物，通過C2-C4、C2-C6鍵與2個(gè)苯駢二氫吡喃環(huán)相連接，形成特定的分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象[6-9]。研究表明，TFs無論在體外還是在體內(nèi)，均具有優(yōu)良的抗氧化、抑菌、抑癌等[10-14]生物學(xué)特性，作為一種天然的膳食活性成分，TFs在食品、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈內(nèi)膜產(chǎn)生脂質(zhì)等血液成分的沉積，同時(shí)血管平滑肌細(xì)胞增生和膠原纖維增多，形成血管壁硬化和粥糜樣含脂壞死病灶，這樣一系列血管病理變化的過程。血管內(nèi)皮細(xì)胞是介于血流和血管壁組織之間的一層單核細(xì)胞，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生環(huán)節(jié)中，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及由此產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，扮演著關(guān)鍵角色，抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷，維護(hù)內(nèi)皮正常的結(jié)構(gòu)和功能，對于抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生至關(guān)重要[16-19]。氧化應(yīng)激損傷是血管內(nèi)皮細(xì)胞常見的病理損傷，活性氧自由基、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）、脂多糖、同型半胱氨酸、高血糖和高血脂等，均可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成結(jié)構(gòu)和功能損傷。氧化損傷會引起內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物增多，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞壞死和凋亡增加，引發(fā)血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)改變和功能障礙[20-21]。在本研究中，H2O2處理血管內(nèi)皮細(xì)胞，會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，致使細(xì)胞外漏LDH水平顯著升高，同時(shí)細(xì)胞NO分泌水平下降，表明細(xì)胞的內(nèi)皮功能顯著受損，而血管內(nèi)皮損傷和功能障礙，是導(dǎo)致心血管發(fā)生的始動(dòng)因素[22-23]。我們的研究顯示，TF能夠有效抑制H2O2對內(nèi)皮細(xì)胞造成的氧化應(yīng)激損傷，降低細(xì)胞ROS水平，減輕脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，提高細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化酶系的活力，維護(hù)細(xì)胞內(nèi)皮功能。這表明TF對于血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有良好的保護(hù)效應(yīng)，長期飲用紅茶攝入TFs，可能對于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化以及心血管病具有一定的積極作用。

值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)茶黃素和茶多酚同樣可以發(fā)揮促氧化作用。研究顯示，高濃度條件下（>50?μmol·L-1）茶黃素能夠顯著誘導(dǎo)牙齦成纖維細(xì)胞和舌癌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GSH耗盡，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，茶黃素的促氧化作用在腫瘤細(xì)胞中更加明顯，因此對腫瘤細(xì)胞具有特異性殺傷作用[24]。另外，研究顯示高濃度EGCG可對體外紅細(xì)胞發(fā)揮促氧化作用，降低膜蛋白巰基含量水平，并誘導(dǎo)膜蛋白聚集[25]?？梢姡椟S素發(fā)揮抗氧化或促氧化作用與其濃度、細(xì)胞類型、環(huán)境條件等密切相關(guān)。在本研究中TF濃度較低，對血管內(nèi)皮細(xì)胞可發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用，高濃度下或者對其他細(xì)胞會發(fā)揮何種作用尚需要進(jìn)一步研究。

另外，綠茶和兒茶素生物學(xué)效應(yīng)的研究廣受關(guān)注，紅茶和TFs由于成分復(fù)雜、含量較低等原因研究較少，近些年來隨著食品分析技術(shù)的發(fā)展，人們對TFs的研究逐漸增多。研究顯示，茶多酚能夠通過抗炎、調(diào)節(jié)血脂水平、抑制LDL氧化修飾、改善內(nèi)皮功能等不同途徑抑制AS的發(fā)生發(fā)展[26-27]；Huang等[28]研究顯示，綠茶多酚EGCG能夠激活A(yù)kt/eNOS信號途徑，抑制高糖引起的內(nèi)皮組織損傷，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的NO分泌功能；另一項(xiàng)研究表明，綠茶多酚能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)，從而對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和存活產(chǎn)生顯著影響[29]；不僅如此，綠茶多酚能夠通過增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞功能以降低血壓，從而對心血管病起到良好的預(yù)防作用[30]。紅茶和TFs對心血管病是否具有同樣的保護(hù)效應(yīng)，它們與綠茶多酚存在怎樣的異同，這值得深入研究和對比。

本研究發(fā)現(xiàn)，TF能夠通過激活Nrf2/HO-1信號通路進(jìn)而增強(qiáng)抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px發(fā)揮保護(hù)作用，Nrf2/HO-1信號通路在細(xì)胞應(yīng)對氧化應(yīng)激過程中至關(guān)重要，TF是如何激活此信號通路增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化反應(yīng)能力的，其作用機(jī)制值得探究。研究顯示，Nrf2受DNA甲基化調(diào)控，其基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平直接影響其表達(dá)水平[31]；TF是否通過影響DNA甲基化調(diào)節(jié)Nrf2的表達(dá)，尚需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

[1] 胡盛壽, 高潤霖, 劉力生, 等. 《中國心血管病報(bào)告2018》概要[J]. 中國循環(huán)雜志, 2019, 34(3): 209-220. Hu S S, Gao R L, Liu L S, et al. Summary of the 2018 Report on Cardiovascular Diseases in China [J]. Chinese Circulation Journal, 2019, 34(3): 209-220.

[2] Du X, Patel A, Anderson C S, et al. Epidemiology of cardiovascular disease in China and opportunities for improvement: JACC international [J]. Journal of the American College of Cardiology, 2019, 73(24): 3135-3147.

[3] Whelton P K, Colantonio L D. Cardiovascular disease risk estimation in China [J]. Annals of Internal Medicine, 2019, 170(5): 340-341.

[4] Hartley L, Flowers N, Holmes J, et al. Green and black tea for the primary prevention of cardiovascular disease [J]. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2013, 18(6): CD009934. doi: 10.1002/14651858.CD009934.pub2.

[5] B?hn S K, Croft K D, Burrows S , et al. Effects of black tea on body composition and metabolic outcomes related to cardiovascular disease risk: a randomized controlled trial [J]. Food & Function, 2014, 5(7): 1613-1620.

[6] 祖勉, 劉艾林, 杜冠華. 茶黃素及其衍生物藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2011(20): 7-11. Zu M, Liu A L, Du. G H. Research progress in pharmacological effects of theaflavin and its derivatives [J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2011(20): 7-11.

[7] He H F. Research progress on theaflavins: efficacy, formation, and preparation [J]. Food & Nutrition Research, 2017, 61(1): 1344521. doi: 10.1080/16546628.2017.1344521.

[8] Takemoto M, Takemoto H. Synthesis of theaflavins and their functions [J]. Molecules, 2018, 23(4): 918.doi: 10.3390/molecules23040918.

[9] Pereira-Caro G, Moreno-Rojas J M, Brindani N, et al. Bioavailability of black tea theaflavins: absorption, metabolism and colonic catabolism [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65(26): 5365-5374.

[10] Peluso I, Serafini M. Antioxidants from black and green tea: from dietary modulation of oxidative stress to pharmacological mechanisms [J]. British Journal of Pharmacology, 2017, 174(11): 1195-1208.

[11] Tan Q Y, Peng L J, Huang Y Y, et al. Structure-activity relationship analysis on antioxidant and anticancer actions of theaflavins on human colon cancer cells [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(1): 159-170.

[12] Imran A, Butt M S, Xiao H, et al. Inhibitory effect of black tea () theaflavins and thearubigins against HCT 116 colon cancer cells and HT 460 lung cancer cells [J]. Journal of Food Biochemistry, 2019, 43(5): e12822. doi: 10.1111/jfbc.12822.

[13] Khanum H, Faiza S, Sulochanamma G, et al. Quality, antioxidant activity and composition of Indian black teas [J]. Journal of Food Science and Technology, 2017, 54(5): 1266-1272.

[14] Lagha A B, Grenier D. Black tea theaflavins attenuate Porphyromonas gingivalis virulence properties, modulate gingival keratinocyte tight junction integrity and exert anti-inflammatory activity [J]. Journal of Periodontal Research, 2016, 52(3): 458-470.

[15] 王洪新, 孫軍濤, 呂文平, 等. 茶黃素的制備、分析、分離及功能活性研究進(jìn)展[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2011, 30(1): 12-19. Wang H X, Sun J T, LV W P, et al. Research progress on preparation, analysis, separation and function of theaflavins [J]. Journal of Food Science and Biotechnology, 2011, 30(1): 12-19.

[16] Huynh D T N, Kyung-Sun H. Therapeutic targets for endothelial dysfunction in vascular diseases [J]. Archives of Pharmacal Research, 2019, 42(10): 848-861.

[17] Zha S Y, Wang F, Li Z, et al. PJ34, a PARP1 inhibitor, promotes endothelial repair in a rabbit model of high fat diet-induced atherosclerosis [J]. Cell Cycle, 2019, 18(17): 2099-2109.

[18] Song C, Wang Y, Cui L, et al. Triptolide attenuates lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in human endothelial cells: involvement of NF-κB pathway [J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2019, 19(1): 198. doi: 10.1186/s12906-019-2616-3.

[19] Yamagata K. Soy isoflavones inhibit endothelial cell dysfunction and prevent cardiovascular disease [J]. Journal of Cardiovascular Pharmacology, 2019, 74(3): 201-209.

[20] Yan R, Yan J, Chen X, et al. Xanthoangelol prevents Ox-LDL-induced endothelial cell injury by activating Nrf2/ARE signaling [J]. Journal of Cardiovascular Pharmacology, 2019, 74(2): 162-171.

[21] Marchio P, Guerra-Ojeda S, Vila J M, et al. Targeting early atherosclerosis: a focus on oxidative stress and inflammation [J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2019: 8563845. doi: 10.1155/2019/8563845.

[22] Tabaei S, Tabaee S S. DNA methylation abnormalities in atherosclerosis [J]. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology, 2019, 47(1): 2031-2041.

[23] Uddin M S, Kabir M T, Jakaria M, et al. Endothelial PPARγ is crucial for averting age-related vascular dysfunction by stalling oxidative stress and ROCK [J]. Neurotoxicity Research, 2019, 36(3): 1-19.

[24] Babich H, Gottesman R T, Liebling E J, et al. Theaflavin-3-gallate and theaflavin-3'-gallate, polyphenols in black tea with prooxidant properties [J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol， 2008, 103(1): 66-74.

[25] 任婧, 張獻(xiàn)清, 邢艷菲, 等. 茶多酚表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯對紅細(xì)胞膜的促氧化作用[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 30(19): 1947-1949. Ren J, Zhang X Q, Xing Y F, et al. Pro-oxidative effect of epigallocatechin 3-gallate on human erythrocyte membranes [J]. Journal of the Fourth Military Medical University, 2009, 30(19): 1947-1949.

[26] 張姝萍, 王岳飛, 徐平. 茶多酚對動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防作用與機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 茶葉科學(xué), 2019, 39(3): 231-246. Zhang S P, Wang Y F, Xu P. Prevention of tea polyphenols on atherosclerosis and relative mechanisms [J]. Journal of Tea Science, 2019, 39(3): 231-246.

[27] Chen X Q, Hu T, Han Y, et al. Preventive effects of catechins on cardiovascular disease [J]. Molecules, 2016, 21(12): e1759. doi: 10.3390/molecules21121759.

[28] Huang H, Jin C Y, Bi X K, et al. Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate promotes reendothelialization in carotid artery of diabetic rabbits by reactivating Akt/eNOS pathway [J]. Frontiers in Pharmacology, 2018, 9: 1305.doi: 10.3389/fphar.2018.01305.

[29] Chu K O, Chan K P, Chan S O, et al. Metabolomics of green-tea catechins on vascular endothelial growth factor stimulated human endothelial cell survival [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66(48): 12866-12875.

[30] Li D, Wang R, Huang J, et al. Effects and mechanisms of tea regulating blood pressure: evidences and promises [J]. Nutrients, 2019, 11(5): e1115.doi: 10.3390/nu11051115.

[31] Guo Y, Yu S, Zhang C, Kong A N. Epigenetic regulation of Keap1-Nrf2 signaling [J]. Free Radical Biology & Medicine, 2015, 88 (Part B): 337-349.

Theaflavin Activates Nrf2/HO-1 Pathway to Alleviate Oxidative Stress Injury in Vascular Endothelial Cells

ZENG Jie, DENG Zhihui, FU Hongjuan, LIU Chang, GU Yi, ZOU Yixin1, CHANG Hui*

College of Food Science, Southwest University, Chongqing, 400715, China

To investigate the protective effect of theaflavin (TF) on injury of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) induced by hydrogen peroxide (H2O2), HUVECs were divided into control group, injury group (0.2?mmol·L-1H2O2treatment) and TF pretreatment groups (2.0, 5.0, 10.0?μmol·L-1+0.2?mmol·L-1H2O2treatment). The TF pretreatment groups were pretreated with TF for 2?h. Then, both the injury group and the TF groups were treated with H2O2for 24?h, while the control group was treated with solvent. Cells activity was detected by the MTT method. The levels of lactic dehydrogenase (LDH), nitric oxide (NO), malondialdehyde (MDA) and the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px) were measured by corresponding detection kits. Reactive oxygen species (ROS), cells apoptosis and protein expression levels were detected using DCFH-DA dying, flow cytometer and Western blot. The results show that cells activity was dramatically decreased in the injury group, and the levels of LDH, cellular ROS, MDA and cells apoptosis increased, while the level of NO and the activities of antioxidant enzymes were declined. TF pretreatment could increase cells’ viability, decrease the level of LDH, maintain the level of NO, and inhibit the increments of ROS and MDA, as well as cells apoptosis. Further study indicated that TF treatment could activate Nrf2/HO-1 signaling pathway, and the inhibitor of Nrf2 could reduce the protective effects of TF on HUVEC cells. In conclusion, TF could alleviate oxidative stress injury in vascular endothelial cells induced by H2O2. The mechanism is at least partly associated with the activation of Nrf2/HO-1 pathway.

theaflavin, vascular endothelial cell, oxidative stress injury, protection mechanism, atherosclerosis

TS272.2；Q52

A

1000-369X(2020)05-632-09

2019-12-24

2020-06-08

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（XDJK2020D030）

曾潔，女，碩士研究生，主要從事植物化學(xué)物及其生物學(xué)活性的研究。*通信作者：changhui2017@swu.edu.cn